Noncoding loci without epigenomic signals can be essential for maintaining global chromatin organization and cell viability
2021 年 11 月 3 日发表在 Science Advances 上。
大部分非编码区域都没有注释信息，甚至没有任何表观或者蛋白质结合信号。然而，它们在稳定染色质三维结构这一方面上的潜在能力一直没有得到很好的研究。为了研究它们对于结构的重要性，研究者们对于与其他片段互作的非编码区域进行了分析，并且进行了 CRISPR 数据库扫描，获得了许多对于细胞生存非常重要的 hub。Hi-C 和单细胞转录组分析显示，这些 hub 的删失会显著影响染色质结构稳定、并且影响末端基因的表达。研究表明，没有任何功能元件的非编码区域也能对三维结构有重要作用，揭示了一种新的疾病相关基因变异（GV）的机制。
CRISPR-Cas9 系统可以用来分析非编码区域，但是删除基因组上所有 5-kb 区域是不现实的。于是研究者们先找出染色质上与其他片段 contact 多的区域着手进行分析。他们将这些区域称为 hub。
用 Hi-C 3D 数据进行分析，先找出了一些 hub，然后再用 CRISPR-Cas9 删除这些区域，研究这些区域对细胞的影响。
从网上下载七个人类细胞系的 5-kb 分辨率的 Hi-C 数据，包括 GM12878、上皮细胞、脐带血管上皮等，找到染色体内相互接触的片段对，然后把它们做成一个网络，称为片段接触网络（fragment contact network, FCN）。注意 contact 指的是空间上的接近，不一定是通过蛋白质或 RNA 等物质结合。将 5-kb 片段作为 node，3D 接触作为 edge，度（degree）则是互作的数目，对每个点的度计算 z 值，超过一定阈值的作为 hub。
为了研究 hub 的重要性，先是研究它们对于稳定 FCN 的作用，然后研究它们与癌症中遗传变异（研究中关注单核苷酸变异）的关系；然后通过 CRISPR 敲除研究这些 hub 对于细胞生存的作用；最后，用 Hi-C 和单细胞 RNA 测序研究 hub deletion 对于染色质结构与基因表达的影响。
片段接触网络 FCN 是一个无标度网络。随机地从网络中移除点，发现对于 FCN 没有很大影响，但是如果针对性地移除度高的点（也就是互作多的点），就会对 FCN 结构产生显著影响。
与癌症相关的变异会影响 hub 在 3D 上的接触。K562 是一个癌细胞系，对细胞系之间 node 的 z 值进行平行比较，发现 K562 特有的遗传变异与这个细胞系中的 degree changes 有关。接下来又多研究了一些正常细胞系和癌细胞系，进一步证实了癌症特有的遗传变异会显著影响 hub 间的 3D 接触。
删除 hub会显著影响细胞生存能力。有的 hub 对细胞生存能力的影响特别显著。
删除 hub 导致的细胞死亡并不是由于功能元件的扰乱或 off-target effect。基于数据库进行分析，发现没有与任何功能元件重叠。考虑到 CRISPR 编辑的脱靶效应，还对影响特别大的 hub_22_7 单独进行了分析，进行了 manual check，排除了这一原因。
删除关键 hub 会影响整体染色质结构。K562 细胞系的 22 号染色体，删除 hub 之后染色质直径增大了。
此外，删除关键 hub 会上调凋亡基因的表达、影响末端区域的基因表达。
删除 hub 在整体上的影响表明，hub 可能能够用于治疗。例如在 K562 细胞系中 hub 的删除使得该癌细胞系特定上调表达的 TOP3B 基因的表达降低了，这是因为 hub 相互作用的与该基因启动子-增强子相互作用。总的来说，删除一个 hub 可能能够增强许多通路来杀死癌细胞，同时削弱癌细胞突变的作用。
