现今最常用的单细胞RNA测序技术是通过形成一个个液滴，让一个液滴内包含一个细胞，对细胞进行裂解，释放mRNA，添加barcode再逆转录成cDNA最后进行批量测序的一个过程。在这一过程中，我们会给同一个液滴内的所有mRNA一个相同的barcode。因为我们假定一个液滴内仅包含一个细胞，因而拥有相同barcode、来自同一个液滴的mRNA，我们在分析中也会当成同一个细胞的数据。
但在实际情况中，有一些液滴会包含超过两个或两个以上细胞，被称之为doublet或multiplet。因为同一个液滴内的mRNA会拥有一样的barcode，当液滴内包含超过一个细胞时，它们依旧会被当做一个细胞处理，在后续分析中，引入一些错误的信息。因为doublet的情况比较常见，也更难被识别出来，我们后续就主要针对doublet进行说明。
我们在进行分析前通常会使用细胞表达的总reads数、细胞表达的基因数以及reads中属于线粒体基因的比例这类信息去对细胞做一个基本的筛选，去除掉一些低质量的数据。在这一过程中，我们能去除掉部分拥有高于正常值的总reads数和基因数的doublet。
但通过这样简单的筛选，有的时候并没有办法完全去除doublet和multiplet。一些分化程度高、只拥有有限、固定功能的细胞，例如肌肉细胞，可能会有比较低的总reads数及基因数。它们只拥有比较固定的功能，因此不需要表达大量不同的基因。当样本中包含这类细胞时，他们与其它细胞在一个液滴中形成的doublet就不会有太高的总reads数及基因数。在这种情况下，我们需要运用一些其它的方法检测出可能的doublet。其中DoubletFinder和scrublet是小L尝试过的两种。
DoubletFinder的整个算法流程主要分为以上这几个步骤。
1. 首先，我们有一个未分析的scRNA数据。
2. 因为doublet是两个细胞被当成了一个细胞处理，DoubletFinder通过随机将两个细胞的基因表达数据相加来模拟可能出现的doublet的基因表达情况，并把这些模拟出来的doublet也当作正常的细胞进行后续的处理。
3. 通过常规的PCA对reads数矩阵（cell×gene matrix）进行降维，更好地对信息进行压缩和提取。
4. 找出每一个细胞的邻近细胞（neighbors）
5. 在这些细胞中，包含了我们数据中原有的细胞，也包括模拟出来的doublet。DoubletFinder会计算出每个细胞的邻近细胞中包含多大比例模拟出来的doublet。比例高即说明这个细胞和模拟出来的doublet相似，即更有可能是doublet。DoubletFinder用一个用户自己设定的值pANN作为分界线，高于设定的pANN即为doublet。
6. 去除DoubletFinder认定为doublet的细胞。
DoubletFinder是一个基于R的doublet检测工具，在它的GitHub主页上，作者给出了如何将它与seurat结合进行分析的代码。在实践过程中，小L发现两个问题。
一是作者给出的范例仅针对我们有一个样本数据的情况下。如果我们有多个样本时，在分析的哪一步进行doublet检测就变得复杂起来了。我们是在对数据进行基础的筛选以及去除批次效应（batch effect）之后呢，还是之前呢？是使用原始的reads数呢？还是使用标准化（normalization）之后的reads数呢？
二是使用DoubletFinder最终会产生一个非常大的seurat对象（object），但其中可能有很多信息是我们不需要的，如果不进行合理的信息提取，会占用大量的计算资源，在样本数量多的情况下，甚至会导致更严重的后果。小L习惯使用Rstudio server进行数据分析，在使用DoubletFinder就曾经因为要分析多个sample，数据太大，导致Rstudio server崩溃。几经调试才找到合适的处理的方法。
小L进行了不同的尝试，翻阅了一些资料，还参考了运用类似思路进行doublet检测的不同工具的使用方法，最后得出结论：应该使用DoubletFinder根据它的tutorial直接对多个样本进行依次分析，先判断出每个细胞是否为doublet，再对它们一起进行过滤（filtering）、整合（integration）等操作。因此，我们在DoubletFinder进行分析后，只需要保留它的结论以及pANN值添加到我们原始数据的metadate里，就能进行后续分析了，不需要保留整个DoubletFinder分析产生的seurat对象（object）。
由于这一块的内容比较多，关于scrublet算法的分析、DoubletFinder和scrublet的比较以及相关的代码范例就放到下一篇内容里写。
祝大家吃好喝好睡好、远离新冠、科研快乐~
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