今天给大家分享一篇，高通量筛选的文章，该文章发表于2020年3月的Cell Reports上，文章的题目是《High-Throughput Screens of PAM-Flexible Cas9 Variants for Gene Knockout and Transcriptional Modulation》，讲的是用高通量筛选技术，去筛选对基因敲除以及基因的转录调控相对有效的可识别灵活PAM的Cas9突变体。

按照惯例，先来了解下作者团队。作者们来自NEW YORK GENOME CENTER，通讯作者Neville E. Sanjana似乎在张锋实验室也待过。

NEW YORK GENOME CENTER官网

回到文章，我们来看看文章的一个研究背景，作者在SUMMARY中也提到了，主要是依托于2个Cas9突变体的发现—识别NG PAM的xCas9和Cas9-NG。

这里多说一句，xCas9是David Liu团队在2018年2月发现的，发了篇nature，文章名字是《Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity》；Cas9-NG是来自日本的团队在2018年9月发现的，他们与张锋团队也有合作，文章发表于Science，文章名字是《Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space》。感兴趣的可以去了解学习下。

回到本文，作者想利用高通量筛选技术，比较下spCas9以及xCas9和Cas9-NG在基因敲除，基因转录激活、抑制上，谁的表现更好，同时，以期能够在筛选过程中，设计开发出更优的Cas9突变体。

文章的SUMMARY及提到的两篇文章

我们来看下作者的设计思路以及逻辑（下图1）。

首先，作者选择了CD45，CD46和CD55共3个基因作为靶向区域来分别设计sgRNA。作者对每个基因的TSS（转录起始位点）上下游各1.5kb（共3kb）以及CDS区设计不同PAM的sgRNA（见下图2）。文中用到的载体都是在lentiCRISPRv2（Plasmid #98290）上改造的。以CD45基因为例，在该基因的敲除上，用到了3种敲除载体（sgRNA相同，包含TSS区和CDS区的），分别使用了Cas9，Cas9-NG和xCas9，作者使用不同的Barcode来区分不同的载体。然后，将这3种载体分别转染K562细胞系，再通过puro分别去筛选阳性细胞，获得了3种细胞类群，并通过细胞计数，将3种细胞类群的相同数量阳性细胞混到一起培养一定天数。最后，利用流式细胞仪将细胞分选开，以此筛选出敲除效果好的Cas9酶。作者将这种筛选方式称为Competition Screen，意思是竞争性筛选。

这里再啰嗦一句，作者选用的CD45等基因是膜蛋白类基因，可以通过相应抗体进行荧光标记（细胞免疫组化），然后进行FACS（流式细胞荧光分选），将荧光强和弱的细胞群体分选开，针对敲除来讲的话，如果荧光强，就表明敲除效果差，而荧光弱，就表明敲除效果好，这就是作者的筛选逻辑。

还是以CD45基因为例，在基因的激活转录表达上，作者参照Cas9在D10A/H840A处的突变获得的失活的dCas9，同样获得了dCas9-NG和dxCas9突变体。并利用VPR元件，构建了用于激活转录表达的3种载体（dCas9，dCas9-NG和dxCas9载体），之后筛选的方式就同上述敲除筛选的方式。如果荧光强的话，就表明激活转录表达的效果好，反之，效果差。

此外，在CD45基因的抑制转录上，原理同激活类似，只是构建了不同的载体，转染获得了不同的细胞系。这里不再赘述。

我们可以看到，只是针对CD45基因，作者就构建了9种载体（敲除，激活，抑制各3种），转染筛选出了9个细胞类群。3个基因的话，就需要构建27种载体，27个细胞类群。工作量还是很大的。

图1 实验流程图

图2 CD45，CD46和CD55的sgRNA设计

我们再来看一下实验结果：

RESULT 1：Cas9-NG Targets NGH PAMs with 2- to 4-Fold Lower Nuclease Activity Than Cas9 at NGG PAMs

筛选获得的细胞群体富集到的sgRNA统计分析

通过竞争性筛选，作者发现WT Cas9在NGG位点的敲除效果最好，同时解释了，虽然Cas9-NG和xCas9扩宽了PAM的识别范围，但是是以牺牲编辑效率为代价的。

同时，实验结果也表明，xCas9在NGH（H=A,T,C）位点的编辑效率不如Cas9-NG。

RESULT 2：Cas9-NG, but Not xCas9 or WT Cas9, Efficiently Modulates Gene Expression at NGH PAMs

抑制和激活转录表达的sgRNA富集统计分析

作者专门把NGH PAMs富集到的sgRNA进行了统计分析

实验结果表明，Cas9-NG（dCas9-NG）在NGH PAM位点的抑制和激活转录表达的效率上都是强于WT Cas9的。

同时，又再次表明了xCas9在NGH（H=A,T,C）位点的效用是最弱的。

RESULT 3：Introduction of Cas9-NG Mutations in xCas9 Partially Rescues Nuclease Activity and Increases Transcriptional Activation at NGH PAMs

基于上述2个结果，作者就思考，有没有什么办法能够将xCas9在NGH（H=A,T,C）位点的效用给提升。所以，作者就将Cas9-NG的突变给引入xCas9中，构造了一个新的核酸酶，xCas9-NG（见下图）。

构造的新核酸酶，xCas9-NG

然后，我们来看看这个新核酸酶的使用效果。

Cas9-NG，xCas9，xCas9-NG的敲除和激活效率比较分析

结果表明，xCas9-NG相比xCas9在敲除效率上，虽有提升，但效果不明显，且敲除效果均低于Cas9-NG（虚线baseline）。

在激活转录表达上，xCas9-NG相比xCas9的激活效率有较为明显的提升，且远优于Cas9-NG（虚线baseline）。

在抑制效果上，因xCas9-NG抑制效果未有较明显改变，故作者没在正文提，只是将抑制效果对比放在了附件中。这里也不再赘述。

最后，我们来看一下文章的Highlights来做一下总结。

1. 虽然有了很多灵活PAM的SpCas9突变体，但却是以牺牲编辑效率为代价的；

2. Cas9-NG在NG PAMs的效用均优于xCas9；

3. 将Cas9-NG的突变引入xCas9突变体中，创造了一个新型核酸酶，xCas9-NG；

4. xCas9-NG的激活转录表达的调控效果优于Cas9-NG和xCas9。

至此，文章分享就结束了，以上只是我个人对文章的理解，如有不同意见，欢迎大家探讨。同时，希望我的分享对大家理解文章能有所帮助。如果大家觉得有用的话，请帮忙点个赞，谢谢大家。