周三了，大家还好么，一周一周的过着，时间轻飘飘的划过，时间给我们的意义是什么呢？？？？ 我相信，不会是简单这么度过就好，一定有更深层次的理由

这一篇我们继续分享单细胞空间的分析内容，文章在High cardiomyocyte diversity in human early prenatal heart development，用单细胞空间的技术手段，研究心脏的细胞和空间组成，又是单细胞空间占据身心的一天。

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Summary

心肌细胞在心脏发生过程中起关键作用，但对其特征知之甚少，尤其是在产前阶段。因此，通过整合单细胞 RNA 测序、空间转录组学和配体-受体相互作用信息，详细描述了受孕后 6.5-7 周的人类产前心肌细胞。使用为剖析细胞类型异质性、定位细胞类型和探索它们的分子相互作用而开发的计算工作流程，确定了八种发育中的心肌细胞，与人类发育细胞图谱中确定的心肌细胞相比增加了一倍以上。它们在细胞周期活性、线粒体含量和连接蛋白基因表达方面具有高度可变性，并且差异分布在心室（包括流出道）和心房（包括窦房结）中。此外，心肌细胞配体-受体串扰主要与非心肌细胞类型有关，包括与心脏发生相关的途径。因此，早期产前人类心肌细胞高度异质，并发展出独特的位置依赖性特性，具有复杂的配体-受体串扰。进一步阐明它们的发展动态可能会产生新的疗法。

Introduction

心肌细胞 (CM) 是心脏的contracting units。 它们的生长和适应是胎儿早期发育过程中心脏发生的重要因素，此时心脏已经从原始的心血管转变为不断增长的四腔心脏，并且outflow parts of the ventricles are developing。 Elements of the venous pole of the cardiac tube and cardiac mesenchyme related to the sinus venosus, great cardiac veins, and pulmonary veins develop into the trabeculated atrial appendages, atrial septum, central conduit part of the atria, and sinoatrial node (SAN), from which the normal heart beat originates. The atrial structures originating from the veins are myocardialized by CMs, which form the smooth-walled conduit parts of the atria.

然而，这些发育compartments中心肌细胞的分裂、收缩性发育分化、能量产生和电完整性所涉及的机制仍然未知。 因此，需要在产前早期探索 CM 的光谱、规格、生长和与其他细胞的相互作用，以提高对心脏健康、CM 种群发展的了解，从而为心力衰竭的新再生疗法提供潜在途径。

Here, we present a high-resolution characterization of the CM populations at 6.5–7 PCW, achieved by applying a computational workflow developed to dissect and characterize cell type heterogeneity, localize the cell types, and explore their ligand-receptor (L-R) interactions.（细胞特异性和空间临近通讯）

Results

最初应用Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) 对 HDCA 6.5-7 PCW 心脏 scRNA-seq 数据集进行降维和聚类。 为了专门研究人类产前心脏的 CM 异质性，将 726 个细胞与 HDCA 数据集中识别的三个 CM clusters（即心室、心房和富含 MYOZ2 的 CM）相对应。 通过这个过程，出现了八个 CM clusters。 其中，六个（指定的clusters 0-2、4、6 和 7）是表达 MYH7 的心室 CM clusters，两个（cluster 3 和 5）是表达 MYH6 的心房 CM cluster。(单细胞部分的注释)

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Characteristics of ventricular cardiomyocyte populations

三个最大的心室 CM clusters（cluster 0、1 和 2）包含约 75% 的细胞，其线粒体含量、连接蛋白表达和配体 - 受体（L-R）相互作用高于细胞其他三个心室 CM cluster（4、6 和 7）。这表明它们更成熟，形态上整合了更高的氧化、收缩和导电能力。第三大cluster（cluster 2）与基因 IRX3 的强差异表达 (DE) 相关，调整后的 p 值 (p_val_adj ) 为 4.8 × 10⁻¹⁷，这是Purkinje fibers远端部分的特征。该cluster还最强烈地表达了编码间隙连接蛋白 43 和 45（分别为 GJA1 和 GJC1）的基因，它们在快速传导纤维中起关键作用，并且以与传导和信号传导相关的几个基因本体 (GO) terms为特征。总之，这些观察结果表明第 2 组由Purkinje CM 组成。

第二大心室 CM cluster（cluster 1）与糖酵解相关的 GO terms和对缺氧的反应相关，表明高能量产生。 此外，该cluster强烈差异表达基因 HEY2 (p_val_adj 2.5 × 10^-27)，它是 NOTCH 信号传导的下游效应器，在紧凑型 CM 的成熟中起关键作用。 HEY2 抑制 TBX5、NPPA 和 GJA5（编码连接蛋白 40）的心房和trabecular基因表达。 因此，该cluster中的小区具有紧凑CM的特征。

最大的心室 CM cluster（cluster 0）包含大约三分之一的心室 CM。 GO 特征包括比与紧凑型 CM 相关的terms更明显的收缩和膜相关terms。 富集了几个与收缩相关的基因，例如 MYL2、TNNI3 和 MYL3。 HOPX，一种参与 CM 成熟的转录因子也高度表达（p_val_adj 6.3 × 10^-26）。 因此，该cluster中的细胞具有trabecular CM 的特征。

最小的心室 CM cluster（cluster 7）与很少的 L-R 相互作用和 MYH7 和连接蛋白表达的弱表达有关。 独特的 GO terms与间充质发育以及细胞外和细胞骨架特征有关。 G2M 和 S 期的细胞比例很高：分别为 30.4% 和 21.7%。

高度差异表达的基因包括 LGALS1 (p_val_adj 1.2 × 10⁻⁷)、PLAC9 (p_val_adj 5.2 × 10⁻¹³)、ACTG1 (p_val_adj 4.4 × 10⁻¹²) 和 S100A11 (p_val_adj 2.9 × 10⁻¹⁴)。 LGALS1 编码与细胞-基质相互作用有关的 β-半乳糖苷酶结合蛋白，并与细胞内肌节肌动蛋白共定位。 PLAC9 编码与细胞外基质网络有关的糖蛋白。 ACTG1 编码收缩装置的主要组成蛋白； S100A11 编码钙结合蛋白。 这些特性表明该cluster中的细胞是心肌成纤维细胞，主要在outflow tract (OFT CM) 中发育，心室肌、半月瓣和大动脉在此发育.

第二小的心室 CM（cluster 6）的表达基因和转录物数量较少，线粒体基因 MYH7 和 GJA1 的表达较弱。 相关的 GO terms表示高内质网活性。 根据指示蛋白质靶向ER的GO特征，基因YBX1高度差异表达（p_val_adj 8.8×10^-16）并参与RNA分子的识别和microRNA（miR）的外泌体转运。 这些富含外泌体的 CM 可被视为心肌细胞。

第三个最小的心室 CM cluster（高 G2M CM）中的细胞表达的基因和转录物较少，并且表达的线粒体基因少于compact or trabecular CM。 GO terms以及 PTTG1 (p_val_adj 3.9 × 10⁻³⁵) 和 TUBA1B (p_val_adj 9.7 × 10⁻²⁹) 等基因的高差异表达表明 G2M 细胞周期活性显著。 这些高 G2M 心肌细胞可被视为富含外泌体的 CM 与compact, trabecular, and Purkinje CM 之间的中间阶段。

基因表达和细胞周期阶段评分在心室 CM cluster之间和内部变化很大。 所有心室细胞类型包括一些在 G2M 阶段。 线粒体基因表达也是高度可变的。 它在 OFT CMs 中很低，但在compact, trabecular, and exosome-enriched CMs 中也有不同的细胞部分表达低。 这些弱表达的细胞在 HDCA 数据集中定位于富含 MYOZ2 的 CM clusters，而其余细胞则定位于心室 CM cluster。 总体而言，与其他细胞相比，弱表达细胞（占总数的 16%）的表达基因和转录物数量较少，线粒体基因表达较弱，但在 G2M 期的比例较高（26% 对 14%；根据 p < 0.001 卡方检验）。 这些发现表明这些细胞可能是心肌细胞样的。

作为额外的验证，CM scRNA-seq cluster被解卷积到 ST 心脏形态图上，其中六个心室 CM cluster中的四个Anthor到心脏的相关解剖结构。 致密的 CM 主要位于靠近两个心室的心外膜和间隔，而trabecular CM 位于两个心室的内部。 Purkinje fiber相关的 CM 位于左右心室的中远端，而 OFT CM 主要位于流出道。 外泌体相关和高 G2M CM 广泛分布在心室中。

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Atrial cardiomyocyte types（心房心肌细胞类型）

由于 SAN CM 太少而无法通过聚类算法识别，因此使用监督方法将它们检测为共表达 TBX18、SHOX2 和 HCN4 的细胞。在 UMAP 分析生成的图中，显示了两个心房cluster（cluster 3 和 5），SAN CM 位于心房cluster 5 的上端。TBX18 和 SHOX2 仅在cluster 5 中表达：TBX18 特别位于 SAN_CM 区域的上端，而 SHOX2 表达更广泛地分布在cluster 5 中。SHOX2 在 SAN (p_val_adj 2.1 × 10⁻²³) 和cluster中均显著表达5 (p_val_adj 1.2 × 10⁻⁶⁹)。在这个发育阶段，SHOX2（一种中胚层来源的生长因子）的表达仅限于肺静脉口周围的右心房导管区域和左心房导管区域。结果证实，与前心外膜和间充质衍生的转录因子 TBX18一致，SHOX2 通过抑制心肌收缩基因程序的表达参与 SAN 起搏器 CM 的发展。这涉及抑制早期心脏转录因子 NKX2-5（在第 5 组中的表达强度低于第 3 组，在 SAN 中的表达强度低于第 5 组 CM：分别为 p < 0.008 和 < 0.003），导致上调（p < 0.0001) 的传导相关转录因子 TBX3。后果包括 NPPA 下调（在第 5 组中的表达强度低于第 3 组，在 SAN 中的表达强度低于第 5 组 CM：分别为 p < 0.0001 和 < 0.004）和连接蛋白 40 编码基因 GJA5（在组中表达强度较低）cluster 5 比cluster 3：p < 0.0001）。这可以防止 SAN CM 成为收缩快速传导心房 CM。 SAN 中 PPP1R1A 的表达高于cluster 5（p < 0.0001）。该基因编码细胞质蛋白磷酸酶抑制剂，参与信号转导和碳水化合物代谢。

两个心房 CM cluster（cluster 3 和 5）在肌肉收缩性 GO terms中相似，但只有较小的cluster (5) 表达上皮细胞迁移、上皮间质转化、内皮细胞增殖、BMP 和经典 WNT 信号通路。这些差异表明较大的cluster (3) 与原始心房有关，主要发育成小梁心房附件（心房小梁 CM），而cluster 5 与心外膜和间充质发育的心房中央平滑壁部分有关和大静脉，包括肺静脉（心房导管 CM）。 SAN CM 的 GO terms与传导、动作电位调节和心率有关。这可能是因为显微解剖转录组图的空间网格中的每个点可能代表 20-30 个细胞，当然，这些细胞可能包括不同的共定位细胞类型。

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Spatial colocalization of different cell types(空间共定位)

器官发育过程中不同细胞类型之间的相互作用非常重要。通过将来自 HDCA 的非心肌细胞 (non-CM) 单细胞cluster解卷积到 ST 点上，可以可视化共定位的细胞类型，从而获得关键细胞及其在局部发育中相互作用的指示。心外膜衍生细胞、与较大和较小脉管系统相关的成纤维细胞样细胞、成纤维细胞样平滑肌细胞和心脏骨骼细胞、内皮细胞和Schwann祖细胞在这些斑点中均较高。在具有独特心房导管 CM 的 ST 点中，观察到类似的细胞类型组成，尽管也存在心外膜细胞。非心肌细胞类型的分数较低。这表明 CM 在 OFT 区域（主要发育事件包括主动脉、肺动脉和半月瓣的分隔和形成）中发挥的作用可能不如它们在心房中发挥的作用，在心房中肌肉形成是主要发育事件。

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Ligand–receptor crosstalk

不同 CM 类型之间的 L-R 相互作用的数量很低，几乎没有整合素相互作用。 相比之下，心室 CM 和非 CM 细胞之间的相互作用在区域性致密、小梁和浦肯野相关 CM 中显着且最高，它们也具有最高数量的整合素相互作用，表明结缔组织和血管结构在 心脏发育和 CM 发育和锚定。

在 OFT CM 点中，大多数检测到的 L-R 相互作用是在与血管发育、内皮细胞、心外膜衍生细胞和雪旺氏祖细胞相关的成纤维细胞样细胞之间。 OFT CM 与这些细胞类型之间的串扰相对较弱，可能是因为 CM 在 OFT 发育中起次要作用，这涉及隔膜和瓣膜形成。 在确定的 27 个 OFT CM 相互作用中，12 个涉及整合素，具有来自和朝向 OFT CM 的特定 L-R 相互作用。 在非整合素中，OFT CMs 表达胎盘生长因子，其作用于刺激内皮生长和血管生成的几种受体（FLT1、NRP1、NRP2）。 更多的非 CM 配体作用于 OFT CM，反之亦然。

L-R 相互作用的复杂性体现在涉及表皮生长因子受体 (EGFR) 的那些方面，它参与各种非 CM 细胞类型和 OFT CM 之间的串扰，具体取决于所涉及的配体（NRG1、TGFB1、MIF 或 GRN）。 这与 EGFR 在二尖瓣和血管结构发育中的作用一致。 参与相互作用的其他药物包括 BMP、LRP1（低密度脂蛋白受体）和 TNFR。 BMP 是 TGF-β 超家族的成员，与 NOTCH 信号一起调节 CM 增殖。 LRP1 影响心肌细胞脂质摄取，而 TNFR 激活可能参与细胞凋亡，并被描述为募集心脏祖细胞和刺激 OFT CM。 LGAL、NCAM1 和 ESAM 是参与细胞与细胞和细胞与基质相互作用的配体。 因此，确定的 LR 串扰揭示了 OFT CM 在其环境中发展的基本方面。

富含外泌体的 CM 散布在整个心室肌中。 只有 32 个检测到的这些细胞的 L-R 相互作用是显着的，其中 11 个涉及整合素。 整合素配体仅在富含外泌体的 CM 中表达，表明与非 CM 的单向结合。 FGF 和 VEGF 配体都通过共定位细胞中的各种受体起作用，TNF、BMP、NPPA 和甲状腺氨酸激酶 AXL 也是如此，影响平滑肌、成纤维细胞和内皮细胞。 影响富含外泌体的 CM 的细胞外指导信号包括 L-R 与淋巴结形态发生素 TGF-β 对 LEFTY2_TDGF1 和 CD47_SIRPA 的串扰，表明这些 CM 处于早期发展阶段。 SIPRA 是一种在心肌细胞祖细胞和早期心肌细胞中表达的细胞表面受体。

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Discussion

In conclusion, our combined analysis of single-cell and spatial transcriptomic analysis, as well as L-R crosstalk between spatially colocalized cell types, reveals a complex landscape of dynamic changes in the cellular composition, expression patterns, and functions of CMs in the early prenatal human heart. Our approach also provides a strategy to characterize further the combined and publicly available single-cell and spatial transcriptomics resources.

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