1. 简介
康复期血浆治疗(CPT)在20世纪初开始应用于病毒性感染治疗。然而，中和血浆需要标准化、给予的中和抗体滴度低、存在潜在安全问题以及血浆供体不足等问题的存在限制了临床应用。1975年Kohler and Milstein成功地将骨髓瘤细胞系与B细胞融合产生杂交瘤，进而导致单克隆抗体的发展与广泛应用。从那时起，人们越来越关注利用单克隆抗体治疗感染性疾病。帕利珠单抗是FDA与1988年批准的首个抗传染病单抗。此外，单克隆抗体也已被批准用于治疗其他病毒，如艾滋病病毒、埃博拉病毒和狂犬病病毒。
流感病毒属于正粘病毒科，单股负链RNA分节段病毒。根据核与基质蛋白的抗原差异性可以将流感病毒分为A-D四个属。甲型流感病毒(IAV)可感染多种宿主，而乙型和丙型流感病毒(IBV、ICV)主要感染人类。丁型流感病毒(IDV)迄今为止已观察到只感染牛、山羊和猪。根据流感病毒表面的糖蛋白——血凝素（HA）和神经氨酸（NA）的遗传特性与抗原特性，IAV被分为不同的亚型。季节性H1N1、H3N2和IBV严重危害着儿童、老年人和免疫缺陷患者的健康安全。据估计，全球每年有25万至50万人死于季节性流感感染。与此同时，IAV可以跨越物种间屏障迅速传播，并因其可能引起大流行而引起极大关注。自20世纪以来，发生了四次禽流感大流行，涉及三种亚型(H1N1、H2N2和H3N2)。最严重的流行病之一是1918年H1N1引起的西班牙流感，造成约5000万人死亡。
流感病毒不断的变异对疾病防控提出了巨大的挑战。其中，疫苗接种是预防流感的关键方法，作用机制为通过诱导中和抗体的产生来预防感染。但是由于病毒的快速突变，需要经常根据流感流行株的亚型进行调整。目前，疫苗的生产周期较长，诱导的免疫持续时间较短。另一方面，疫苗的效力也会受到宿主免疫状态的影响。例如，年轻人、老年人和免疫缺陷个体更容易感染流感。通常，季节性疫苗不能提供针对大流行毒株的交叉保护。抗流感药物可用于治疗流感感染，但是因其耐药性导致应用的局限性。因此，迫切需要一种更为普遍的解决方法来应对流感病毒。广谱中和抗体通过被动免疫的方式进行预防和治疗的手段可能成为潜在的应对手段。到目前为止，许多针对IAV与IBV的广谱中和抗体已经在临床前和临床阶段进行了研究并展现了很好的保护作用。本文介绍了流感病毒的两种主要表面糖蛋白HA和NA，并对具有不同表位的广谱中和抗体的研究进展、中和机制进行了详细介绍。同时，本文还讨论了广谱中和抗体的临床发展，指出流感中和抗体研究领域的一些独特的挑战。此外，本文还基于表位的流感病毒疫苗设计进行了讨论。
2. 抗流感病毒的广谱中和抗体综述
HA和NA是在流感病毒表面的两种主要糖蛋白，介导病毒进入和子代病毒颗粒的释放，是保护性免疫反应的主要靶点。IAV具有18个HA和11个NA亚型，而IBV分为两个谱系，Victoria和Yama – gata。
2.1 广谱中和抗HA抗体
2.1.1 HA结构与功能
HA作为宿主体液免疫反应和疫苗接种的主要靶点，由RNA片段4编码并组装为同源三聚体。HA由HA1和HA2两条链形成的三聚体组成，它们通过二硫键连接。HA通常分为免疫显性头部和免疫亚显性茎。受体结合位点(RBS)位于HA头部，主要促进病毒识别宿主细胞膜上的唾液酸受体，然后启动病毒内吞作用。内体的酸性环境导致裂解的HA2发生构象变化，进而促进宿主细胞与病毒包膜融合。HA1蛋白上的RBS是单克隆抗体的一个重要靶点。大多数通过抑制病毒附着受体起作用，还有一些通过在三聚体中桥接相邻的头来阻止融合。HA2包含融合相关结构域，包括螺旋A和融合肽，它们主要介导HA构象变化并诱导膜融合。靶向HA茎的单克隆抗体作为融合抑制剂发挥作用。一般来说，与HA头部相比，HA茎是一个明显保守的区域，因此是广谱抗体的潜在靶点。
2.1.2 靶向HA的广谱中和抗体
HA头部比HA茎具有更强的免疫原性，针对该位点的抗体（尤其是RBS）具有很强的效力，因为它们可以阻断病毒附着或直接通过空间障碍阻止受体介导的进入，从而在生命周期的早期抑制病毒感染。然而，由于高度的序列可变性和糖基化模式不同，针对HA头部引发的抗体反应比较特异。然而，一些靶向RBS保守位点的抗体在IAV的不同亚型中表现出异常广泛的反应性，如S139/1、C05和F045-092。同样，针对RBS的CR8033和C12G6交叉中和Yamagata和Victoria亚型。此外，一类广谱中和抗体(S5V2-29、H2214、Flu-20) 在HA融合前识别了隐藏在HA头三聚体界面的保守表位。Flu-20通过阻止病毒细胞间传播，对大多数IAV亚型表现出非常好广谱性。此外，还观察到一些广谱中和抗体在RBS以外的地方识别HA1头部，但是对H1与H3亚型的中和能力有限。
HA茎是参与病毒包膜-宿主细胞膜融合过程的一个相对保守的区域，因此靶向该区域的抗体通常能够中和多种IAV亚型，甚至与IBV交叉反应。这些抗体根据中和抗原的特异性可以分为四类——1型特异性抗体、2型特异性抗体、1和2型异亚型抗体、IAV和IBV异亚型抗体。1型特异性抗体(C179,F10,CR6261,3.1,3E1) 靶向HA中央茎上相似的表位，主要包含Trp-21疏水口袋和螺旋A区。同时观察到一些例外，靶向于HA茎的一个离散的膜-近端锚定表位，且能够与H1、H2和H5亚型交叉反应。2型特异性抗体(9H10、CR8020、CR8043)靶向于HA茎的近端膜基质部。虽然有一些重叠，但与anchor表位相比CR8020和CR8043靶向的表位在HA茎更向上、更右。随着抗体发现的深入发展，越来越多的1型和2型抗体被鉴定为同型的（FI6v3和MEDI8852）。这些抗体可能非常灵活，它们可以采用不同的结合模式来适应高度可变的序列以及不同的糖基化位点。由于系统发育距离较长，交叉中和IAV和IBV的抗体极为罕见，CR9114就是这样一种抗体。无论是在体外还是体内都对IAV与IBV有很好的中和能力。尽管HA茎是保守的，但仍有一些可变性。有某些表位残基或聚糖可以限制跨亚型免疫。例如，2型HA1上的聚糖N38对诱导2型抗体反应提出了重大挑战，但是Fl6v3和MEDI8852可以克服这一问题。此外，针对HA茎部的CR8020容易收到抗原漂移与宿主选择压力的影响。H7N9已经表现出对抗体CR8020的免疫逃逸。同时有研究指出：由于HA茎的结构差异，H3亚型对HA茎部的广谱中和抗体的抗性遗传屏障低，H1则较高。这些研究强调了HA茎部表位的可变性，以及开发广谱疫苗的挑战。
大多数HA茎靶向的抗体的机制包括抑制HA0裂解为HA1和HA2，并阻止低pH诱导的膜融合。一些HA茎部抗体在参与ADCC、ADCP和CDC。一些研究还揭示了HA茎部抗体通过位阻阻断NA活性来减少病毒释放的机制。
2.2 广谱中和抗NA抗体
2.2.1 NA结构与功能
NA由另一种至关重要的表面糖蛋白RNA片段6编码，是一种四聚体II型跨膜蛋白，具有氨基端疏水序列，并在病毒粒子包膜上形成板或帽状结构。每个NA单体包括细胞质结构域、跨膜区域、茎和球状头结构域。NA酶的活性位点位于每个亚基的中心，其周围的表面环含有抗体结合位点。尽管不同NA亚型之间存在较大的序列差异，但N1-N9之间的催化位点残基表现出显著的保守性。具体来说，残基R118、D151、R152、R224、E276、R292、R371和Y406直接参与唾液酸结合。NA主要用于切断唾液酸与HA的结合，使病毒颗粒释放并促进病毒传播。此外，与HA相比，NA的抗原漂移速度较慢。因此，NA催化位点及其边缘是广谱中和抗体结合位点是通用疫苗的潜在靶点。
2.2.2 靶向NA的广谱中和抗体
有大量证据表明，对NA的免疫可以提供预防流感感染的保护。多克隆抗体对NA的广泛反应性在小鼠中提供了对异种病毒的保护。先前对人的研究也表明，预先存在的NA反应性抗体具有降低感染发生率和减轻疾病严重程度的潜力。一些靶向NA的抗体通过直接结合到保守的催化位点，并已被鉴定出对IAV和IBV具有交叉反应性，如兔单抗HCA-2和人源单抗1G01。此外，NA催化位点外的表位也被观察到被某些NA亚型特异性抗体识别(抗N9单克隆抗体NA-63、NA-80和NA-22，抗N1单克隆抗体CD6、2H08和3H03)。动物模型中的流感病毒攻击实验显示了NA抗体的保护作用。具有NA抑制活性的抗体通过位阻或直接结合催化位点阻断唾液酸的裂解，从而阻碍新形成的子代病毒粒子的释放。此外，抗NA体也可以参与Fc介导的作用，在体内保护小鼠免受流感病毒感染。
总的来说，这些研究表明，在合理免疫或自然流感病毒感染下，HA和NA抗体都可以被诱导。广谱中和抗体及其识别表位的制备和表征将为设计下一代通用流感疫苗提供有用的信息。
3. 抗流感病毒单克隆抗体临床研究进展及思考
3.1 抗流感病毒单克隆抗体的临床研究
已经对几种广谱中和抗体进行了评估，以评估其在临床试验中的安全性和治疗潜力。迄今为止，所有临床试验的广谱中和抗体都针对IAV的HA茎区，除了一个针对基质蛋白。在人类流感病毒感染控制模型的临床研究中，观察到广谱中和抗体具有显著的保护作用。例如，在2009年H1N1大流行病毒感染后24小时静脉注射2300mg VIS410抗体，与安慰剂组(NCT02468115)相比，曲线下病毒载量中位数面积显著减少91%。另一种抗体MHAA4549A在人类H3N2侵袭模型中也显示出显著的治疗效果(NCT01980966)。然而，尽管VIS410和MHAA4549A治疗组在症状缓解和病毒复制方面起作用，在对非并发症甲型流感感染(NCT02989194和NCT02623322)的门诊患者进行的临床试验中，与对照组相比，未观察到清除病毒载量的时间显着减少。对于MEDI8852，一种广谱抗体具有中和18种IAV HA亚型的潜力。一项临床研究评估了MEDI8852在成人无并发症流感患者中的疗效。研究发现，MEDI8852与单独使用奥司他韦的治疗结果没有显著差异。此外，当两种药物联合使用时，没有观察到额外的益处。
在没有并发症的甲流门诊病人中，抗体的临床保护效果有限可能归因于以下几个原因。在感染流感病毒和出现症状之间通常有48小时的间隔。涉及门诊患者的临床试验通常在症状出现2-5天内开始治疗，这表明病毒感染已经存在4-7天，这是病毒复制的高峰期。延迟给药可能会影响治疗效果，这种情况类似于使用奥司他韦的时间限制。患者选择也会影响门诊患者的临床疗效。回顾抗SARS-CoV-2抗体治疗，多用于疾病进展高危门诊患者的早期治疗。因此，合适的临床应用场景和人群对提高流感病毒中和抗体的疗效至关重要。
3.2 使用广谱中和抗体抗流感能否成为疫苗接种的可行替代方案?
传统的流感疫苗需要每年更新来应对流行的病毒，这突出了通用疫苗的必要性。广谱中和抗体的被动免疫可能是预防病毒感染的一种可行策略。大量文献表明，HA抗体在预防实验中可保护小鼠或灵长类动物免受致死性流感病毒感染。然而，大多数抗体都是在治疗性临床试验中进行的，目前还没有证据表明HA茎部抗体在临床试验中具有预防作用。
为了开发一种广泛有效的预防性抗体，我们有几件事要考虑。首先，目前用于临床试验的大多数流感抗体方案都使用单一抗体。两种或三种抗体的组合可能有更好的治疗效果和减少病毒逃逸。此外，除了一种基质蛋白抗体外，目前所有的临床试验都只关注HA茎部抗体。虽然已有大量文献报道NA抗体在体外和小鼠模型中具有保护功能，但在临床实践中，它们的效果如何，NA和HA抗体的联合用药的效果都尚不清楚。此外，通过修改广谱中和抗体的Fc延长半衰期，它可以提供5-6个月的保护，这足以度过每年的流感高峰期。这样，长半衰期的广谱中和抗体就有可能成为预防流感的药物，甚至可能取代疫苗。
4. 反向疫苗学——基于表位的通用疫苗设计
4.1 反向疫苗学的概念
尽管针对流感病毒的季节性疫苗已经很成熟，但它需要每年更新以应对新的突变株，并且在预防大流行毒株方面存在困难。反向疫苗学，也称为基于抗体或表位的疫苗学，是基于抗体-抗原相互作用的结构基础设计和工程免疫原来诱导广谱抗体。此外，它们在广谱疫苗抗原和表位的鉴定中起着至关重要的作用。
4.2 基于HA茎部疫苗
虽然HA头部仍然是目前流感疫苗开发的重要靶标，但HA茎也可以成为靶标。然而，HA头部较强的免疫原性掩盖了茎区的免疫原性，导致产生的靶向HA茎抗体相对较少。
为了增强抗体对HA茎的反应，已经提出并实施了几种策略。一种有希望的方法是开发无头HA免疫原。该策略包括从整个HA蛋白中去除HA头，随后进行几轮基于结构的修饰，以产生稳定的无头HA。有几项研究已研制出基于H1或H3/H7亚型的无头HA疫苗，显示出对异种毒株的完全保护，但弱或无跨组保护。此外，HA茎能够被融合并展示在细菌铁蛋白上——这使得形成自组装纳米颗粒成为可能。上述疫苗策略的临床实验已经在2021年完成，但尚未公布正是结果。另一种策略是使用嵌合HA进行序贯免疫，这种嵌合HA使用来自同一亚型的HA茎，而HA1结构域来自不同亚型。嵌合HA序贯免疫可以诱导产生交叉亚型的中和抗体，并保护小鼠免受同源和部分异源病毒的攻击。但是对1群HA的交叉保护强，2群HA的交叉保护弱。因此，H1和H3无头HA联合疫苗可能引起对不同病毒的跨组保护。总而言之，这些基于HA茎的免疫原有可能成为广谱疫苗的有效候选者。
4.3 基于NA的疫苗
一系列识别NA活性位点的广谱抗体已被鉴定和表征。其中许多是从流感感染或接种疫苗的个体中分离出来的。NA与HA的漂移并不密切对应。NA和HA抗体在体外已显示出一定的协同效应。当HxNy病毒的HAx发生抗原漂移时，NAy特异性抗体可能反而有助于限制病毒的复制。基于DNA的疫苗已显示出对流感病毒的保护作用。然而，大多数基于DNA的疫苗研究都处于临床前阶段。诱导针对NA靶向的广谱中和抗体是NA疫苗面临的主要挑战。NA的免疫原性可受蛋白结构、酶稳定性和活性的影响。一项研究发现，四种灭活疫苗中NA的浓度存在显著差异，每剂浓度从0.02 μg到10.5 μg不等。一项针对六种已获许可的三价流感疫苗(TIV)的血清抗HA和NA抗体反应的随机比较研究显示，在相似的HA剂量下，三价流感疫苗在健康成人中引起相似的血清抗HA抗体反应。灭活疫苗都能诱导血清中针对N1和N2 NA蛋白的抗NA抗体，但NA反应不同。目前的流感疫苗不能充分呈现必需的NA表位，很少触发NA反应的B细胞。相比之下，流感病毒感染产生NA反应性B细胞的速度与H1N1相当或超过H3N2 HA反应性B细胞。因此，引入NA抗原的质量检测可能会提高现有疫苗的效力和广谱性。由于它们有可能促进人类对流感的免疫，因此迫切需要制定NA质量和NA抗体诱导的指南。
5. 总结与展望
抗体在临床试验中对埃博拉、SARS-CoV-2、RSV等传染性疾病显示出保护作用。在过去的几年里，许多对IAV和IBV广谱抗体已从免疫动物或接种疫苗或流感病毒感染个体中分离出来。尽管在一些广谱抗体的临床试验中显示了中低疗效，但尚未进行预防性临床试验。利用抗体抗击COVID-19的经验表明，抗体在治疗和预防方面具有保护作用。需要进一步优化和设计临床试验来证实流感抗体的有效性。另一个关键问题是流感抗体能否作为疫苗接种的可行替代方案。然而，对于预防性使用，需要额外的临床试验来证实。SARS-CoV-2抗体预防性临床试验的成功，揭示了流感抗体的预防作用。然而，也有一些挑战不容忽视。为了确保对更广泛的流感病毒有效，预防性和治疗性抗体应足够广泛。此外，抗体药物通常比小分子药物生产成本更高，这可能限制了它们的广泛使用。根据已发表的临床试验，抗流感抗体对重症患者的效果可能有限。
目前，市场上的大多数流感疫苗都是针对特定毒株的，可能无法有效应对大流行。广泛中和抗体识别的表位为通用疫苗的设计提供了线索。各种平台已用于流感病毒疫苗，如重组蛋白，DNA, VLP载体和mRNA。关于通用流感疫苗的临床研究目前进展缓慢。正在进行的研究主要集中在病毒更保守的区域，如HA茎区，以及来自不同流感亚型的HA的组合。另一种可能的抗原选择是NA。与HA相比，NA的进化速度较慢。然而，NA在疫苗生产中的剂量方面尚未标准化，并且尚未进行临床试验以评估其安全性和有效性。在未来，通用疫苗设计的关键仍然是降低高度可变区域免疫原性，同时强调保守区域的免疫原性。强效免疫佐剂的进步将增强疫苗的广谱性和有效性。mRNA疫苗在COVID-19大流行期间发挥了重要作用，最近在流感疫苗方面取得了进展。几种基于HA的候选疫苗目前正在进行临床试验。例如，含有H1N1、H3N2、Yamagata和Victoria亚型四种HA成分的mRNA-1010 (Moderna corporation, USA)显示出相当大的潜力，但其安全性和有效性需要进一步的临床研究。Moderna将继续开发流感候选疫苗。这包括设计更多的HA抗原以覆盖更多的A型流感亚型，并结合HA和NA抗原以减少病毒逃逸。mRNA技术的优点是不需要病毒培养，这允许更快的疫苗生产和更准确地选择疫苗株，特别是在接近冬季的时候。然而，仍有许多技术上的困难需要克服。一个潜在问题就是需要提高抗流感mRNA疫苗的持久性。虽然mRNA疫苗通常是安全的，但也有对某些配方过敏反应的报告。此外，许多研究报告称，流感病毒会提高SARS-CoV-2感染的严重程度和致死率。因此，有必要考虑将广泛中和抗体和通用流感疫苗的想法扩展到SARS-CoV-2，以创建针对流感和SARS-CoV-2的中和抗体药物和疫苗。
