1 介绍
DNA中碱基的化学修饰一直是生命科学领域研究的热点之一。上世纪中期，就发现DNA胞嘧啶可以被甲基基团修饰，被修饰的碱基称为5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine5mC），被认为是第5种碱基。
5mC是一种重要的表观遗传学标记，在基因表达调控、基因印记、X染色体失活以及胚胎发育等生物学过程中起到重要的作用。
BS-seq：通过BS处理，将非甲基化的C转化为U，而甲基化状态的C保持不变，通过简单的测序便可对甲基化修饰信号进行检测，极大的简化了研究手段，促进了表观遗传学的发展。BS就像是一个转化器，将“修饰信息”转化为“碱基信息”。
甲基化如何调控DNA表达：
- DNA甲基化的形成 普通的C变为 mC。
- DNA甲基化的维持 DNA复制过程中，新合成的互补链如何保留原互补链的信息。
- DNA去甲基化 移除旧的信息，才能写入新的信息。
2 分析流程
bismark--DSSoredmr
首先bismark通过bowtie对参考基因组构建索引并将测序文件比对回参考基因组，之后进行去重复，最后对甲基化位点进行识别并生成网页版报告，这样就完成了上游的分析
基因表达过程中的复杂调控
3 代码展示
前面工作和基因组测序差不多
#构建索引
bismark_genome_preparation --path_to_bowtie /software/bowtie2-2.2.3/ --verbose ref/
##这里ref是fasta的路径
#比对
bismark --bowtie2 -N 0 -L 20 -p 5 --sam -o test-mapping-out ref/ /WGBS-example/test_data.fastq
# -N 0 是在比对的时候允许0个错配信息，-Ｌ20是在比对的时候建立的seed大小为20 (类似与k-mer，20-36之间)
# -sam指输出的格式为sam，这里是单端测序文件，如果是双端需要使用-1 -2 参数指定双端fq文件。
去重复并生成最终注释文件
#去重复
deduplicate_bismark -s test-mapping-out/test_data_bismark_bt2.sam
#识别到甲基化的C
bismark_methylation_extractor -s --comprehensive --no_overlap --bedGraph --counts --buffer_size 1G --report --cytosine_report --genome_folder ref/ test_data_bismark_bt2.deduplicated.sam -o ./CpGout
##-s 单端测序，双端用-p，--bedGraph 识别甲基化位点后输出bedGraph文件，--buffer_size 指定使用内存，--report --cytosine_report 生成报告文件，--genome_folder 输入参考基因组以及索引的路径。
less -S ./CpGout/test_data_bismark_bt2.deduplicated.bismark.cov.gz
chr1 564677 564677 0 0 1
chr1 564692 564692 0 0 1
chr1 564698 564698 0 0 1
chr1 566715 566715 0 0 1
chr1 566724 566724 0 0 1
chr1 566732 566732 0 0 1
chr1 566740 566740 0 0 1
chr1 567206 567206 0 0 1
chr1 567239 567239 0 0 1
chr1 569745 569745 0 0 1
chr1 910856 910856 100 1 0
chr1 910868 910868 100 1 0
chr1 910870 910870 100 1 0
# 第一列代表染色体
# 第二，三列代表染色体起始终止位点
# 第四列代表甲基化百分比
# 第五列代表甲基化数目
# 第六列代表未甲基化数目
bismark还支持生成网页版报告
#生成网页版报告
bismark2report --alignment_report test-mapping-out/test_data_bismark_bt2_SE_report.txt
##甲基化率针对某个位点，甲基化比率针对整个基因组
随后就可以使用DSS或者edmr等R包进行后续的差异分析啦
