文献笔记Detection of Microbial Infections Through Innate Immune Sensing of Nucleic Acids.

Tan, X., et al. (2018). "Detection of Microbial Infections Through Innate ImmuneSensing of Nucleic Acids."Annu Rev Microbiol72: 447-478.

摘要:先天性免疫系统通过胚系编码的模式识别受体(PRR,Pattern recognition receptor)来识别微生物的入侵。由于大多数微生物病毒在其生命周期中都含有DNA和/或RNA,因此对于核酸的识别是宿主先天性免疫防御的一个重要策略。病原体来源的核酸可以被特定的宿主PRR识别,这些PRR位于内体溶酶体(endolysosome)和细胞质中。PRR的活化能触发信号级联反应,造成IFN-I和促炎症细胞因子的积累,导致宿主细胞处于抗菌状态,激活适应性免疫,最终清除感染。这篇综述总结了最近几年内,在感染过程中先天性免疫对核酸的识别方面的进展,这些先天性免疫系统包括内体中的Toll样受体,核酸的RNA感受器,细胞质DNA感受器。作者还讨论了传染性微生物是如何对抗宿主核酸的识别以及如何逃避免疫监测的。

前言

在不断变化环境中,动物已经进化出了广泛的生物系统来维持机体的稳态。环境或病毒的变化会导致细胞处于各种应激状态(cellular stresses),细胞中的应激感受器能识别这些应激状态,导致应激应答通路的激活。其中一个应激状态就是微生物病原体的入侵。微生物种类繁杂,数量众多,脊椎动物经常面临这些微生物的入侵,这些微生物的入侵并非每次都能得到很好的控制。先天性免疫系统是机体防御的第一道关卡,它们能识别微生物病原体,触发细胞内与细胞间的信号通路,对抗感染。宿主的胚系编码的模式识别受体(PRRs)能识别微生物病原体上的独特的病原体相关分子模式(PAMPs, pathogen-associated molecular patterns)。感染过程中,病原体诱导的细胞损伤或应激也能被宿主检测到。早期的研究指出了细胞表面PRR在识别病原体方面的重要作用。但是,最近的研究集中在胞内菌的识别方面。在病原体PAMPs中,微生物的核酸识别已经成了先天性免疫系统识别方面研究的热点,因为所有的微生物病原体都依赖于它们的DNA和/或RNA进行复制。

现已发现了识别胞内病原体来源核酸的三种先天性免疫感受器:第一,位于内体(endosome)上的TLRs,这是一种跨膜蛋白,它能识别内体中各种微生物来源的DNA和RNA;第二种是细胞质内针对微生物的DNA感受器;第三种是细胞质中DNA感受器(参见表格1)。维甲酸诱导基因I(retinoic

acid–inducible gene I,RIG-I)样感受器(RLRs)能识别细胞质中病原体来源的RNA病原体来源的RNA,而cGAMP(cyclic

GMP-AMP)合成酶(cGAS)则能识别细胞质中的DNA。一些免疫细胞的AIM2(absent in melanoma 2)也能识别细胞质中的DNA。大多数识别核酸的TLRs主要表达在免疫细胞中,例如巨噬细胞,树突细胞,B细胞,相比之下,几乎所有的细胞都能表达各种水平的细胞质RNA与DNA感受器。

所有的核酸感受器都能直接结合并激活它们的下游信号衔接(adaptor)蛋白,但cGAS除外,cGAS则是会产生一个小分子第二信使cGAMP,cGAMP再结合并激活位于内质网上的衔接蛋白STING(STING也被称为MITA,ERIS与MPYS)。信号转导衔接蛋白的活化会通过IRF3或IRF7来激活NF-κB和/或I型干扰素的分泌,从而导致促炎症细胞因子的产生。AIM2激活细胞质中的炎性小体,炎性小体催化并产生炎症细胞因子,例如IL-1β,IL-18,并且会诱导焦亡(pyroptosis,这是一种炎性细胞死亡形式)。I型干扰素的通过旁分泌与自分泌的形式发挥作用,它结合并激活异IFN-α受体1的二聚体(IFNAR1与IFNAR2)。受体的结合导致相关信号转导通路的活化,这些通路会诱导干扰素刺激基因的转录(ISGs,interferon-stimulated genes),从而抑制病原体的复制和组装。此外,促炎性细胞因子与趋化因子还会通过招募中性粒细胞,激活巨噬细胞的方式来发挥它们的清除病原体的作用。I型干扰素,炎性细胞因子和其它免疫调节分子会进一步诱导并强化适应性免疫系统的活化,也能发挥清除病原体的作用。

在这篇综述里,作者讨论了内体与细胞质中的感受器是如何识别来源于微生物病原体的核酸的。作者主要讨论了核酸识别,信号转导,以及病原体逃避宿主先天性免疫识别通路的分子机制。

 

微生物感染时宿主对核酸的识别

所有的微生物病原体都使用DNA或RNA作为其基因组,在复制的过程中还会产生其它的核酸中间物。因此,对于这些核酸的识别是宿主细胞作为一种识别各种微生物病原体的常规机制。各种核酸感受器不同的亚细胞定位和表达可以使宿主细胞能够有效地捕获各种入侵的病原体。由于微生物病原体的基因组核酸以及复制策略的特征不同,不同的病原体会将它们的DNA或RNA暴露在宿主中不同的亚细胞区室。内体溶酶体(Endolysosomes)与细胞质是这些微生物核酸存在的主要位点。虽然一些病原体则能进入侵宿主的细胞质,但是,大多数的细胞和病毒通过内吞作用(endocytosis)进入宿主的细胞质中的,此后,病原体从内体(endosome)逃逸到细胞质中,或者是被传递到溶酶体(lysosome)被清除。此外,在细胞质中,一些病原体和它们的复制中间产物被通过自噬作用(autophagy)被困在自噬体(autophagosome)中,这些自噬体会与溶酶体融合。因此,内体溶酶体(endolysosome)是微生物核酸暴露的一个常规位点,有5个TLR家族成员对此进行监测,分别为TLR3(识别dsRNA),TLR7(识别ssRNA),TLR8(识别ssRNA),TLR9(含有CpG基序的单链未甲基化的DNA)(注:CpG全称为cytosine-phosphate-guanine),TLR13(识别细菌23S核糖体RNA催化核心上的一段特定序列)。由于每个TLR识别不同核酸的特征,因此,免疫细胞内体中的TLRs可以检测许多微生物的感染。

但是,大多数非免疫细胞并不表达有核酸识别功能的TLRs,并且病原体可以通过进入细胞质来逃避内体的识别。不过,即使在这种情况下,微生物的感染仍然会诱导一个强烈的先天性免疫应答,因此细胞质中存在PRRs,包括一些DNA与RNA感受器(表格1)。识别病原体来源的RNA的细胞质感受器是3个RLR家族成员,分别为RIG-I,MDA5(melanoma differentiation associated gene 5),LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)。而细胞质中识别病原体来源的DNA感受器主要是cGAS,在某些免疫细胞中,还包括AIM2。在这一部分中,我们主要讨论典型的微生物以及识别它们的宿主核酸感受器。

RNA病毒

病毒是地球上最广泛的生命形式,根据它们的基因组和复制策略,可以将病毒分为7个大类。大多数的RNA病毒基因组就属于7大类中的3类,即dsRNA,正义链ssRNA或反义链ssRNA。RNA病毒的复制通常发生在细胞质,在每类RNA病毒复制时,它们或许都会产生dsRNA与ssRNA中间产物。因此,宿主的先天性免疫细胞并不能很好地区分这三类RNA病毒。在内体通路方面,TLR3识别dsRNA配体,但是它也能检测另外两类病毒。除了dsRNA逆转录病毒(reoviruses)外,TLR3能识别一系列(-)ssRNA病毒,例如人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV),以及一些(+)ssRNA病毒,例如微小核糖核酸(Picornaviridae)科的病毒,例如脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis

virus,EMCV),柯萨奇病毒(coxsackie

virus),还能识别黄病毒科(Flaviviridae)的病毒,例如西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)。相比之下,TLR7和TLR8更偏向于识别ssRNA配体,它们能识别弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水泡性口腔炎病毒(vesicular stomatitis

virus,VSV),与正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)的甲流病毒(influenza A virus),这两类病毒都是(-)ssRNA病毒。

细胞质中的RNA感受器RIG-I和MDA5也能识别大多数的RNA病毒。RIG-I通常5’端携带的两个或三个磷酸的病毒RNA结合,而MDA5则更偏向于结合更长链的dsRNA配体。RIG-I和MDA5都能识别特殊与普通的RNA病毒各类。RIG-I偏向的病毒包括一些(-)ssRNA病毒,例如HRSV,VSV与甲型/乙型流感病毒,以及一些(+)ssRNA病毒,例如黄病毒科的丙肝病毒,日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV),副黏液病毒科(Paramyxoviridae)的新城鸡瘟病毒(Newcastle disease

virus)和仙台病毒(Sendai virus,SeV)。MDA5则能识别微小核糖核酸(Picornaviridae)科的EMCV病毒与小儿麻痹病毒(polio virus)。虽然RIG-I与MDA5有着差异,但是它们能识别一些相同的病毒,例如dsRNA逆转录病毒和一些(+)ssRNA病毒,例如黄病毒科(Flaviviridae)的登革病毒(dengue virus)和WNV病毒。LGP2是RLR家族的第三个成员,它本身没有内在的信号转导活性,LGP2据说能调控RIG-I和MDA5的信号转导。一些文献指出,LGP2在调控MDA5介导的针对小核糖核酸病毒(picornavirus),例如EMCV和门果病毒(mengo viurs)的应答方面发挥正向调控作用。有意思的是,细胞质中的DNA感受器cGAS也能识别WNV和登革这两种RNA病毒的感染,这有可能是通过识别它们感染后诱导的宿主细胞损伤导致的DNA泄漏而实现的,例如登革病毒的病毒会诱导线粒体DNA泄漏到细胞质中,从而被cGAS识别。

DNA病毒

DNA病毒的基因组是dsDNA或ssDNA,大多数的DNA病毒会进入细胞核中进行复制,因为DNA病毒的复制需要一些宿主的复制机制。常见的一些DNA病毒包括,1-型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1),腺病毒(adenovirus),人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV),牛痘病毒(vaccinia virus,VACV)与巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV),cGAS都能识别上述病毒,当细胞质中的DNA与cGAS结合后,就会激活cGAS。AIM2最初报道指出,它能识别DNA病毒的感染,例如VACV与小鼠巨噬细胞病毒。但是,最近研究发现,在体内,cGAS也能作为一个重要的CMV感受器。MCMV感染的小鼠会出现两个阶段的干扰素生成,但是只有第一阶段是cGAS/STING依赖的,这一阶段对于抑制病毒的复制有着重要的作用。因此,cGAS是一个重要的识别DNA的先天性免疫感受器。

逆转录病毒(Retroviruses)

逆转录病的基因组是RNA或DNA。RNA逆转录病毒有(+)ssRNA,但是它的复制依赖于逆转录。一旦感染了逆转录病毒,病毒的RNA就会被逆转录为DNA,然后插入到宿主的基因组中,接着病毒的DNA就会进行正常的转录,表达。因此,从原理上来说,在感染期间,一个RNA逆转录病毒也许会将它的RNA,DNA和/或RNA:DNA杂交核酸暴露出来。但是,人类的机体中含有大量内源性逆转录病毒元件,并且不会造成明显的病理性后果;因此机体中必然存在着一些机制用于阻止先天性免疫识别对于内源性逆转录病毒的识别。一个最典型的RNA逆转录病毒就是人类免疫缺陷病毒(HIV)。HIV能够通过多种机制来逃避先天性免疫系统的识别,保护自己。当这样的保护出现障碍时,机体就能快速地检测到HIV的感染,接着机体就会出现一个强烈的抗病毒应答。例如,TREX1是一个宿主细胞质的外切酶,它能够降解逆转录病毒反转录出来的DNA,阻止DNA在细胞质中的积累。在人类和小鼠巨噬细胞和DC细胞实验中,敲除细胞中的TREX1,使用HIV感染会导致病毒的DNA在细胞中积累,从而被细胞质中的感受器,例如cGAS所识别;此外,逆转录活性也是cGAS活化的一个前提条件。一旦识别出由HIV的RNA或其它逆转录病毒RNA转录而来的DNA时,cGAS就会合成第二信使cGAMP,用于激活下游的信号转导级联反应,诱导I型干扰素的表达。

DNA逆转录病毒是一小类病毒,它们携带有dsDNA基因组,但是它们能在细胞核中合成(+)ssRNA链,此链也被称为前基因组RNA(pregenomic RNA),即pgRNA,pgRNA再在细胞质中进行逆转录,用于病毒基因组DNA的复制。最好的案例就是乙肝病毒(HBV),全球有数亿人感染HBV。虽然HBV感染能向宿主细胞引入病毒的DNA和RNA,但是先天性免疫系统对HBV的应答则很微弱,并没有明显的I型干扰素的产生。即使这样,最近有文献报道,MDA5和RIG-I能够作为HBV的感受器。在人类肝细胞系与小鼠细胞系中敲除MDA5后,HBV的复制能增加。但是,其它的研究也指出,是RIG-I识别了HBV的pgRNA,而非是MDA5。RIG-I与HBV的pgRNA结合不仅能介导III型干扰素的产生(III型干扰素包括IFN-λ1,2和3),还能通过干预HBV的聚合酶P向pgRNA的招募来抑制病毒的逆转录过程。无论是MDA5还是RIG-I对HBV的识别似乎取决于病毒的基因型,因为有的研究团队使用了不同基因型的HBV得到了矛盾的结果。事实上,由于在逆转录过程中缺乏校正机制,HBV会出现许多基因型,亚基因型以及突变体。

细菌

细胞病原体通过吞噬作用(phagocytosis)进入宿主细胞,随后被内体中的TLR9和TLR13(人类方面未发现TLR13)识别。TLR9能识别细菌未甲基化的CpG DNA,而小鼠的TLR13则能识别细菌的23S核糖体RNA。细胞质中的DNA感受器也能识别细菌。例如有报道指出,cGAS能识别各种胞内菌,例如沙眼衣原体(Chlamydia

trachomatis),单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes),土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)。土拉弗朗西斯菌感染巨噬细胞会激活AIM2炎性小体。虽然cGAS和AIM2都是dsDNA感受器,但是它们偏好不同的配体。在识别新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)来源的DNA方面,cGAS与AIM2就有着不同的作用。新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)的感染首先会通过cGAS途径来诱导I型干扰素的产生,导致鸟苷结合蛋白(guanylate-binding proteins,GBP)的表达。在GBP的辅助下,宿主因子,即免疫相关的GTPase家族成员B10(IRGB10,immunity-related GTPase family member B10)就会被招募到细菌表面,诱导细菌DNA的释放,激活AIM2。

最近几年在研究核酸感受器识别分枝杆菌的方面取得了巨大进步。虽然结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis )经过内吞作用(endocytosis)进入吞噬体(phagosome),并驻留其中,但是结核分枝杆菌能够通过它的ESX1分泌系统(VII型分泌系统,一个6kDa的蛋白)透过吞噬体的膜,这就有利于细菌的DNA暴露在细胞质中。早期的研究支持AIM2在体内是一个重要的结核分枝杆菌感受器。最近的几个研究团队则指出,cGAS在识别结核分枝杆菌方面发挥着重要作用,cGAS识别病原体后,随后宿主细胞会产生IFN-β。有文献指出,AIM2和cGAS能与结核分枝杆菌来源的DNA在细胞质中共定位,这种结论可以扩展那到那些有可能通过ESX1分泌系统的细菌因子方面。

内体核酸识别

TLRs是研究最广泛的PRR,它们主要表达在免疫细胞中,TLRs能够识别来源于微生物病原体PAMPs。在TLRs中,TLR3,TLR7,TLR8,TLR9和TLR13都是跨膜蛋白,它们能识别内体吞噬体中的核酸(图表1,表格1)。因为大多数的微生物是通过内吞作用(endocytosis)或吞噬作用(phagocytosis)进入宿主细胞的,因此TLRs为内体区室提供了一个有效的感染监测机制。

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配体识别与TLR活化

识别核酸的TLR是一个单跨膜蛋白,它们含有一些相似的结构域结构:一个用于识别PAMP的胞外域(ectodomain),这是一个跨膜蛋白,一个C开端细胞质Toll/IL-1受体(TIR)结构域。胞外域与内体吞噬体内腔中不同特征的核酸结合。最近几年,在理解TLR对它们配体识别与活化的结构基础方面取得了巨大进步。

TLR3识别dsRNA。TLR3的胞外域由一个N端为富亮氨酸的重复序列(LRR,leucine-rich

repeat)构成,接着是23个LRRs,C端是一个加帽结构域。TLR3会形成一个马蹄铁样的螺线型结构。一旦TLR3与配体结合,胞外域就会与dsRNA形成复合物,此复合物像一个三明治一样,两个胞外域分子夹着一个dsRNA,其中dsRNA呈现出右手A-DNA样结构。虽然TLR3被高度糖基化,但是每个胞外域还是含有一个不含糖基的一侧,它们含有两个RNA结合位点,可以与配体的磷酸糖骨架相互作用,这使得它们可以通过一种非序列依赖的方式进行RNA识别。在中等酸性的pH环境例如前溶酶体(endolysosome)中,一个必需组氨酸残基的咪唑(imidazole)基团提供的质子化作用能够提供正电荷,这是结合带有负电荷的dsRNA所必需的条件。

TLR7/8识别ssRNA。TLR7/8/9高度同源,每个都含有26个LRR,以及中间呈现一个Z环结构。与TLR3不同的是,这三个TLR的胞外区是一个环状线圈结构,其N端与C端直接结合。失活状态下的TLR7胞外域是一个单体;配体的结合会诱导它们形成一个M形状的对称二聚体结构,其中C位于中心。每个二聚体会与两个小分子结合,例如鸟嘌呤核苷或瑞喹莫德(resiquimod)(R848),或者是两个ssRNA(UUU)结合。每个小分子会完全嵌合在二聚化的表面,而每个UUU则会与两个胞外域以及Z-loop的凹面结合。TLR8与TLR7不同的是,TLR8不需要配体的结合就能预形成一个二聚体,但C末端的TIR结构域处于一个非活化的二聚体状态,互相远离。尿苷与富含GU的ssRNA一旦与之结合(以一种类似于TLR7结合的方式),就会诱导TLR8二聚体表面的重构,使它们的C末端相互接近。对于TLR7和TLR8来说,小分子配体都能单独诱导它们的活化,而不仅仅是ssRNA。但是,ssRNA的结合会增加它们对来源于ssRNA的鸟嘌呤核苷和尿苷的亲和力。

TLR9识别细菌CpG DNA。TLR9的胞外域与TLR7类似,TLR9的胞外域在没有配体结合的情况下,也是一个环状线圈单体。当含有CpG的细菌ssDNA与之结合时,它会形成一个2:2的复合物,每个CpG DNA分子的表面会接近。表面1来源于一个胞外域的N端,它与DNA上的碱性部分结合,而表面2来源另外一个胞外域的C端,它与DNA的骨架结合。最近又发现了TLR9的另外一个结合位点;它能与5'末端第二位点携带了胞嘧啶的DNA结合(5’-xcx DNA)。这个另外的结合位点对应着TLR7和TLR8的核酸结合位点。当CpG

DNA存在时,5’-xcx DNA与TLR9结合,形成2:2:2复合物,它们对于优化TLR9的信号转导有着重要意义。

TLR13识别细菌23S rRNA。小鼠表达TLR13,人类不表达TLR13。TLR13能识别一个保守的单链序列,即CGGAAAGACC,该序列位于细胞23S rRNA的催化中心。当TLR13与23S rRNA结合时,会诱导TLR13形成一个M样的2:2二聚体,此二聚体含有两个TLR13胞外域和两个RNA分子。每个胞外域会与ssRNA配体形成一个椭圆形状的结构,以适应内部的凹陷区。RNA配体形成的一个茎环样的结构是TLR13识别所必需的结构。RNA配体的2’羟基基团参与形成重要的RNA特异性氢键,从而维持茎环样结构,这就解释了TLR13是如何区分DNA与RNA的。

TLR的信号转导

配体的结合会诱导TLRs及其胞质TIR结构域的寡聚化,通过招募衔接蛋白(adaptor proteins)开启下游信号转导。除了TLR3是招募衔接蛋白TRIF(TIR-domain-containing

adapter-inducing interferon-β),(TRIF也被称为TICAM1,即TIR-domain-containing adaptor

molecule-1),其余的TLR则是招募MyD88(myeloid differentiation primary response 88)。TRIF开启信号转导级联反应,导致以IRF3和NFκB的活化,而MyD88则激活NF-κB,IRF4与IRF7(图表1,表格1)。在下面的部分中我们会以TLR3和TLR7/9为例来讨论一下它们下游的细胞信号转导,从而理解核酸诱导的TLR信号转导。


TLR3信号转导。在内体溶酶体中,dsRNA与TLR3的结合有利于TIR结构域的寡聚化,反过来TIR的结构域与衔接蛋白TRIF结合。除了TIR结构域外,TRIF还含有一个N末端结构域(NTD),与一个C端受体相互作用蛋白1(RIP-1,C-terminal receptor-interacting

protein 1)同型相互作用基序(RHIM)。失活的TRIF会通过分子内的相互作用处于一种自抑制状态,它会屏蔽TRIF与下游分子的结合位点。TRIF和TLR3之间的TIR-TIR相互作用会诱导TRIF的寡聚化与活化。活化的TRIF会与肿瘤坏死因子受体结合因子3(TRAF3, tumor necrosis factor receptor–associated factor 3)结合,TRAF3随后招募而来的TANK结合激酶1(TBK1,TANK-binding kinase 1)和κBε抑制剂(IKKε)复合物重要的泛素连接酶。TRIF/TBK1复合物会进一步招募并磷酸化IRF3,导致IRF3的二聚化,产生IFN-β。

除了IRF3外,TRIF还能激活NF-κB通路。在静息状态下,NF-κB是一个异二聚体,它由p65和p50构成,在细胞质中,它与抑制亚基IκB结合,处于了屏蔽状态。活化的IKK复合物能磷酸化IκB,IKK复合物由一个催化亚基IKKα和IKKβ,以及一个调控亚基NEMO构成,磷酸化的IκB会经历多聚泛素化与蛋白酶体降解,释放出NF-κB,使之进入核中,开始促炎症基因的转录。TRIF的RHIM结构域与与受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIPK1,receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1)结合,激活转化生成因子β(TGF-β)活化激酶1(TAK1),导致IKK的活化。在RIPK1敲除的小鼠胚系成纤维细胞(MEF)中,poly(I:C)诱导NF-κB的活化受损,但是IFN-β的产生则是完整的,这说明TRIF介导的IRF3活化与NF-κB独立的。

TLR7/9信号转导。TLR7和TLR9通过衔接蛋白MyD88来进行信号转导,诱导IFN-α与促炎症细胞因子的产生。这两条通路都能特异地激活IRF7,而非IRF3,进而诱导I型干扰素的产生。此外,TLR7和TLR9通过激活的是IRF7,而非TBK1或IKKε。衔接蛋白MyD88含有一个N末端死亡结构域,这是一个中间结构域,还含有一个C末端TIR结构域,这个TIR结构域能与TLR7/9的TIR结构域相互作用。通过TIR-TIR的相互作用,MyD88分子被招募到受体复合物上,它们的死亡结构域二聚化。MyD8的活化会诱发MyDD小体(MyDDosome)信号转导复合物的形成,MyDD小体由MyD88,IL-1受体结合激酶(IRAK)家族激酶IRAK4和IRAK1/2构成。MyDD小体的形成是由MyD88和IRAK的死亡结构域的寡聚化诱导的。MyDD小体然后会促进IRAK4的反式自身磷酸化与活化,导致IRAK4介导的IRAK1/2的磷酸化与活化。MyD88和IRAK1能直接招募IRF7,导致IRAK1介导的磷酸化,激活IRF7。遗传学的证据与之相符,IRAK4和IRAK1的激酶活性参与IFN-α的合成。另外一个激酶IKKα也参与IRF7的活化,但是IRAK1和IKKα之间的功能关系还不清楚。

TRAF6和TRAF3是两个E3泛素连接酶,它们参与TLR7/9通路中IRF7的活化。但是泛素过程是如何促进IRF7活化的,还不清楚。TRAF6参与NF-κB的活化,以及TLR7/9信号转导下游的炎症细胞因子的产生,TRAF3则无此作用。NF-κB的活化是由TRIF下游的一个类似机制介导的,这涉及到TABk1和IKK复合物的招募。TLR7和TLR9诱导促炎症细胞因子(IFN-α除外)需要另外一个转录因子IRF5的参与,IRF5也是MyD88和TRAF6的下游信号分子。IKKβ在Ser462位点磷酸化IRF5,这种磷酸化对于诱导促炎症细胞因子有着重要的作用。IRF5和NF-κB都能与这些促炎症细胞因子的启动子区结合,导致转录激活。


TLR的转运与微生物核酸的识别

由于核酸识别的TLRs能从内体溶酶体中开启信号转导级联反应,因此它们从ER转运到内体溶酶的这个事件是它们发挥功能的前提(图表1)。CpG DNA的刺激能诱导一个强烈TLR9转运,将它从ER转运到内体溶酶体中,而用TLR7的激动剂咪喹莫特(imiquimod)以及其它的并不能激活TLR7的刺激物,例如CpG DNA或LPS刺激时,TLR7也能发生转运。各种刺激物诱导TLR转运的精确机制还不清楚,但是一个驻留在ER的蛋白unc-93同系物B1(UNC93B1)则对所有这些内体的TLRs转运有着重要作用。UNC93B1通过它们的跨膜结构域直接与TLRs结合,将TLRs驻留在ER来源的囊泡中,进一步被转运到高尔基体与后高尔基体(post-Golgi)内体溶酶体中。小鼠或者是UNC93B1缺陷的患者会出现核酸识别TLRs信号转导的障碍,这与前面提到的研究是一致的。TLR9介导的通路会在内体溶酶体区室中进一步被后高尔基体转运精确调控。在浆细胞样DC中,TLR9位于早期内体中,当用CpG-DNA刺激时,经能激活NF-κB通路,释放促炎症细胞因子,但是IRF7的活化用于产生干扰素I的过程要依赖于衔接蛋白复体物3(AP3)介导的TLR9转运,将TLR9转运到一个LAMP2阳性内体(这个LAMP2阳性内体我的理解就是,使用LAMP2抗体染色,呈现阳性的内体)中。延长信号转运复合物(含有MyD88,IRAK4,IRAK1,与IRF7)在内体膜中的驻留时间会导致pDCs产生大量的IFN-α。在酸性区室中,TLR转运到内体溶酶体会导致TLRs的蛋白酶解过程;有文献报道,这样的过程参与内体中TLRs(包括TLR7和TLR9)的活化。


细胞质中微生物RNA的识别

虽然TLRs能够通过内体核酸识别系统来识别各种微生物的感染,但是这个系统也有自己的局限,因为很多非免疫细胞并不表达TLR,并且在内体溶酶体中,配体与TLR的结合对于结合方向也有要求。因此,除了内体外,还有识别微生物更加普遍的方式。在早期的研究中,人们发现了两个可以被dsRNA激活的抗病毒蛋白。一个是干扰素诱导的2’ 5’ 寡腺苷酸合成酶 (oligoadenylate synthetase,OAS),当OAS与dsRNA结合时,会合成2’5’-寡腺苷酸,触发由核糖核酸酶RNaseL介导的病毒RNA降解。另外一个蛋白就是dsRNA依赖的蛋白激酶R(PKR,dsRNA-dependent

protein kinase R),这是一个丝氨酸/苏氨酸激酶,一旦被dsRNA结合并活化,它会通过磷酸化真核起始因子2(eukaryotic initiation factor 2)的α亚基来抑制病毒的复制,因此会抑制病毒mRNA的翻译。后来有研究团队发现,细胞质中RNA诱导的,TLR非依赖的干扰素应答依赖于细胞质中的RNA感受器,例如RIG-I,MDA5,以及它们的下游信号衔接蛋白MAVS(MAVS全称为mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS也称为IPS-1, VISA和CARDIF)。IRG-I和MDA5识别的细胞质dsRNA可以激活MAVS信号转导,激活I型干扰素和促炎症细胞因子的表达(表格1)。I型干扰素诱导一连串的ISGs,例如OAS,PKR,用于对抗病毒感染。

RIG-I样受体识别细胞质中微生物的RNA

RIG-I样受体家族包括三个成员,IRG-I,MDA5,LGP2,它们都驻留在细胞质中,识别病毒RNA结合。所有的RLRs都拥有一个C末端结构域(CTD)和一个中间RNA解旋酶结构域用于催化ATP的水解。RIG-I和MDA5的N末端含有一个串联caspase招募结构域(CARDs,caspase recruitment domains)(LGP2不含此结构),CARD能直接与MAVS结合,激活下游的信号转导。LGP2不含CARD,它自身不能激活MAVS,但是有文献指出,LGP2能调控dsRNA刺激的RIG-I和MDA5信号转导。

所有的RLRs能识别病原体来源的dsRNA,只是不同的RLR有一些不同的配体偏好。RIG-I识别携带有5’三磷酸的钝末端短dsRNA,并且对5’二磷酸钝末端短dsRNA有低亲和力,而MDA5被认为能识别病毒来源的长dsRNA,虽然内源性病毒RNA配体激活MDA5的精确机制还不清楚(图表2)。5’三磷酸是许多RNA病毒的一个共同特征,例如HDV,甲流病毒,而5’二磷酸则是被发现于存在逆转录病毒的基因组片段中。相比之下,细胞的RNAs通常能够在5’端被修饰。例如,mRNA会被5’帽子结构修饰,tRNA是由其前体加工而来,它含有一个5’-单磷酸。但是一些细胞的RNA,例如7SL

RNA是由RNA聚合酶III转录而来的,它在5’末端仍然含有未修饰的结构(例如携带有5’三磷酸)。有人认为,RIG-I通过与一些细胞内的蛋白结合无法识别这样的RNA,但是这其中的机制还需要进一步研究。另外一个能够区分宿主与病毒RNA的重要特征就是宿主细胞mRNA的鸟嘌呤帽的2’-O-甲基化,RIG-I不会识别这种结构。病毒的一个逃逸机制就是利用宿主或病毒的加帽酶,以及2’-O-甲基转移酶来修饰病毒的mRNA,将其修饰为跟宿主mRNA类似的形式。IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1,四肽重复干扰素诱导蛋白1)是一个抗病毒蛋白,此蛋白能通过直接结合的方式识别5’三磷酸结构的RNA,但是有文献指出,IFIT1是通过直接将病毒RNA隔离在一个复合物中来发挥抗病毒活性的,此复合物含有IFIT家族成员。病毒mRNA帽子的2’-O甲基化也会导致病毒从IFIT-1介导的病毒蛋白翻译抑制机制中逃逸。


LGP2识别特定RNA特征的机制还不清楚,但是目前知道,LGP2也能与dsRNA高亲和力地结合。有意思的是,宿主对EMCV的识别需要MDA5和LGP2,后者能特异地识别一个反义链RNA,也就是病毒RNA的L区。EMCV RNA的L区对于MDA5的LGP2相关的刺激性RNA配体以及EMCV的识别有着重要的作用。

RIG-I样受体对配体识别的结构基础

所有的RLRs都有一个CTD,它们有着类似的折叠与基础表面,但是它们的RNA结合环的特征则不同。RLRs可以通过它们的CTDs结合dsRNA,只有RIG-I的CTD能特异识别携带了5'二磷酸或5'三磷酸的RNA。如果没有RNA配体,RIG-I就处于自抑制状态,但是它的CTD则是柔性的,含有一个识别RNA末端的5'二磷酸或5’三磷酸的环状结构。CTD一旦捕获配体,解螺旋结构域就会协同结合ATP,RNA就会改变RIG-I,使之形成一个活性结构,CTD与解螺旋结构域就会形成一个围绕着RNA的环状结构,N末端的CARD结构域也会暴露。ATP的水解会促进RIG-I从RNA的5'末端发生转移,这种转移在RIG-I活化方面有着重要的作用。

MDA5和RIG-I含有类似的结构域结构,但是最终的研究指出,MDA5偏向结合更长的dsRNA用于信号转导。MDA5主要通过CTD结合到RNA磷酸骨架和2’羟基基团来与dsRNA相互作用,这与通过序列非特异性的RNA识别方式是相同的。不过RIG-I中的CTD环识别的是5’二磷酸或5’三磷酸,MDA5中的对应的CTD环则不参与RNA的结合。在RNA结合方面一个重要的方面就是,MDA5与dsRNA的茎部结合,而RIG-I则与尾部与dsRNA结合,这就导致了与RNA结合后,MDA5形成一个C型的结构,而RIG-I形成了一个O型结构。MDA5的细丝是以单体的头尾结合方式排列的,这些单体具有广泛的蛋白质-蛋白质相互作用,这就解释了MDA5在dsRNA结合以及对长链dsRNA结合方式具有高度协作性。

LGP2 CTD的结构类似于RIG-I,它也偏向与dsRNA结合,但是对于5'三磷酸结构没表示出明显的偏好。LGP2通过它的CTD末端与RNA末端结合,比MDA5有更强的亲和力。对鸡和人类的LGP2的结构进行的研究发现,LGP2通过它的CTD以及解螺旋结构域与dsRNA结合,参与LGP2介导的,促进MDA5的信号转导。LGP2还能与dsRNA形成丝状结构,但是比MDA5的结合效率要低。有研究团队发现,LGP2的存在会增强MDA5结合RNA的比例,同时却会减弱MDA5细丝的延长,这就导致了会形成更多,更短的MDA5细丝,这种现象被认为它能比只含MDA5的长细丝更好的发挥信号转导作用。在LGP2调控由RIG-I和MDA5介导的先天性免疫信号转导方面,还需要更深入的研究。

泛素化促进RIG-I样受体的寡聚化

RLRs必须被寡聚化才能被活化。RNA的结合能诱导RIG-I和MDA5结构的重构,使之进入活化构象,RIG-I会组装形成四聚体,MDA5会形成更长的丝状寡聚体(图表2)RIG-I的CARD与游离的K63多聚泛素链结合后活化,此事件会诱导RIG-I四聚体的形成,这个复合物对信号转导的活化有着重要作用。RIG-I CARDs还能被K63多聚泛素链结合,进一步增强它的活化。泛素连接酶,例如TRIM25和Riplet会通过合成K63多聚泛素链来促进RIG-I的信号转导。而RIG-I结合的去泛素酶圆柱瘤蛋白(CYLD,RIG-I-associated deubiquitination enzyme cylindromatosis)能通过移除K63多聚泛素链来抑制抗病毒的信号转导。游离的泛素链与RIG-I螺旋轨道的外部结合,发挥稳定四聚体结构的功能,这有可能是通过CARDs的共价多聚泛素化作用来发挥稳定作用的。RIG-I四聚体会形成一个左手单链螺旋结构,这为MAVS的招募和活化提供了结构基础(见下文)。

MDA5的寡聚化也需要它的CARDs与游离的K63多聚泛素链结合。这同时还伴随着多聚泛素介导的MDA5寡聚体复合物的稳定,这类似于RIG-I四聚体的稳定过程。MDA5细丝的形成会将其CARDs接近,触发MDA5细丝外部的CRAD寡聚化。解旋酶结构域的ATP水解会促进构象变化,暴露CARD,导致它的寡聚化。寡聚化的MDA5 CARDs然后招募和激活MAVS,用于下游信号转导。

MAVS的聚集

RIG-I和MDA5都能激活信号衔接蛋白MAVS,MAVS是一种线粒体膜蛋白。因此,对于对各种RNA病毒的感染来说,MAVS对此产生有效的先天性免疫应答有着重要的作用。MAVS含有插入线粒体外膜的C-末端跨膜结构域。MAVS的活化需要它在线粒体表面组装成类似朊病毒的聚合物(aggregates)(图表2)。MAVS聚合物的形成是由MAVS细胞质N端的CARD介导的,该CARD与RIG-I或MDA5寡聚体的串联CARD相互作用。RIG-I四聚体作为一个模板来招募MAVS的每个CARD,导致MAVS组装成有活性的,类似朊病毒的丝状物,这些丝状物有着相同的螺旋结构。螺旋MDA5的细丝也可以作为一个模板来激活MAVS聚合物;但这需要结构学方面的证明。MAVS的朊病毒特异已经得到了生化和遗传学方面的支持。MAVS聚合物的一个特点是它的自我维持机制,这类似于朊病毒。一旦少量的MAVS被被RIG-I或MDA5组装成聚合物,这些聚合物就会进一步招募和激活其他MAVS分子,从而形成大的聚合物。这是一种产生快速,强烈的激活抗病毒信号的独特机制。得注意的是,一个由HCV编码的蛋白酶会在跨膜结构域附近进行位点特异性切割,从而将MAVS从线粒体上移开,打破MAVS的信号转导。但现在从机制上来讲,还不清楚线粒体的定位是如何控制MAVS信号转导的,但是这有可能是通过线粒体膜能支持MAVS的聚集来发挥作用的。

MAVS的信号转导

MAVS通过激酶(包括IKK和TBK1)激活下游信号通路,导致NF-κB和IRF3的激活,它们进入细胞核,启动促炎症细胞因子和干扰素的转录。K63多泛素化是RNA识别途径所必需的,因为在RNA病毒感染时,使用K63R突变体取代内源性泛素时,就会消除IRF3的激活。K63多泛素化不仅促进上述RLRs的寡聚化,而且在MAVS下游信号转导中也发挥着重要的作用。MAVS能通过不同的基序直接招募一些E3泛素连接酶,包括TRAF2、TRAF5和TRAF6。这三个TRAF是激活MAVS下游信号转导的主要E3连接酶,如果敲除这三个连接酶,当RNA病毒感染时,就会导致宿主IRF3和IKK活化的消失。这些TRAF能冗余地促进K63的多聚泛素化,但是对下游信号转导有重要作用的泛素化靶点现在还不清楚。NEMO是IKK和TBK1的调节性亚基,是一个泛素感受器,它通过泛素结合结构来被招募到MAVS/TRAFs复合物上。泛素与NEMO的结合(非是泛素化NEMO)对于MAVS信号转导有着重要作用。NEMO随后会招募IKK和TBK1到MAVS复合物上,导致NF-κB和IRF3的活化。TBK1对IRF3的磷酸化需要MAVS在一个特定序列基序(pLxIS)上被磷酸化;这种磷酸化作用会将IRF3招募到TBK1上,因此会允许IRF3被TBK1磷酸化。MAVS中的磷酸化基序在STING和TRIF中也是保守的,这就解释了为什么使用MAVS、STING和TRIF作为衔接蛋白来发挥信号转导作用,这几个蛋白都有独特的激活IRF3和诱导I型干扰素表达的作用。


细胞质DNA的识别

除了RNA病毒外,所有的微生物病原体都通过DNA进行复制。在正常情况下,DNA驻留在细胞核和线粒体中,而不是细胞质中。因此,细胞质DNA的识别是一种检测各种病原体感染的有效方法,但在宿主DNA细胞质暴露异常的情况下,也会出现自身免疫的风险。过去一直认为胞浆DNA能够触发I型干扰素途径。近年来,大量的蛋白质被认为是细胞质DNA感受器产生的干扰素途径的上游成分。但是在细胞质中存在DNA时,在所有的可能的感受器中,只有敲除了cGAS时,才能完全消除干扰素的产生。遗传证据也表明,当用DNA刺激时,AIM2能激活炎症小体通路。这里我们主要介绍cGAS这个激活I型干扰素产生的DNA感受器,以及AIM2激活炎症小体通路的这个感受器。

在产生I型干扰素方面STING的信号转导

数十年前,研究人员在许多细胞系中都观察到了由细胞质中DNA触发的IRF3介导的I型干扰素产生,这种应答是与TLR9无关,当时TRL9被认为是唯一的能识别DNA的TLR。令人惊讶的人是,B型dsDNA poly(dA:dT)被发现能够诱导I型干扰素和NF-κB的活化,而它们则是依赖于RIG-I和MAVS,RIG-I和MAVS是RNA识别通路中重要的两个成分。随后的研究将认为RNA聚合酶III一个是DNA感受器,它能将poly(dA:dT)转化为5’三磷酸RNA,此物质就是RIG-I的配体。但是,RNA聚合酶III只识别富集AT的DNA序列,而这种特性并不能解释许多细胞系中非序列依赖的RNA应答。

STING是一个含有四个跨膜结构域的蛋白,它定位于内质网的N和C端,被认为是继TRIF和MAVS之后的第三个衔接蛋白,它也能激活IRF3,诱导I型干扰素的产生(图表3,表格1)。STING对DNA诱导的多种细胞类型的I型干扰素的产生是必不可少的,对于宿主防御HSV-1(DNA病毒)的感染有着重要的作用。从STING敲除的小鼠中分离巨噬细胞,或者是从STINGgt/gt这种STING单一氨基酸突变(I199N)的小鼠中分离巨噬细胞发现,STING会出现降解,当对巨噬细胞转染了DNA或者是感染了DNA病毒或细菌后,巨噬细胞无法产生干扰素。这些结果确定了STING是细胞质DNA刺激干扰素产生的一个重要的衔接蛋白。

STING除了对细胞质DNA产生应答外,研究还发现,STING还是环二核苷酸(cyclicdinucleotides, CDNs)的一个直接感受器,例如环二GMP(c-di-GMP)与c-di-AMP,这两种分子是由细菌产生的第二集合(图表3)。CDN最初被发现能通过某种未知的感受器诱导I型干扰素应答,后来发现这种感受器就是STING。STING直接与c-di-CMP结合,一个c-di-GMP分子分应会适应一个STING二聚体的中心口袋结构。但是,在所有的这些结构中,C末端尾部后最后40个氨基酸对于STING的信号转导有着重要的意义,它是不可见的,这可能是由于此区域存在着结构上的灵活性。


环状GMP-AMP合成酶是一个细胞质DNA感受器

虽然STING能直接识别细菌的CDN,但是它不是一个DNA结合蛋白。事实上,在针对细胞质的DNA产生I型干扰素的应答方面,STING是一个重要的蛋白,这表明在STING的上游存在着一个常规的细胞质感受器。通过生化的分析手段,作者的团队发现,在细胞质中,DNA的刺激会激活STING。通过生化的纯化手段,这种活性被发现来源于一个小分子,即cGAMP,这是在哺乳动物体内发现的第一个CDN。后来发现,当宿主细胞识别了DNA后,合成cGAMP的这种酶是cGAS(图表3)。cGAS包含一个核苷酸转移酶(NTase)结构域,该结构域在结构上与RNA识别酶OAS的催化结构域同源。在各种的哺乳动物细胞中敲除了cGAS后,用细胞质DNA刺激或者是DNA病毒感染,I型干扰素的诱导就会完全消失。此外,cGAS的缺陷会导致小鼠对致死的HSV感染更加敏感。cGAS还能识别许多其它DNA病毒逆转录病毒的感染,这就包括HIV。这些结果表明,cGAS是一个常规的细胞质DNA感受器,它能产生第二集合cGAMP来激活STING,导致I型干扰素的产生。

晶体结构表明,DNA的结合诱导了cGAS的二聚化,并与两个dsDNA分子形成了2:2的复合物。每个cGAS分子含有两个DNA结合表面,每个表达与dsDNA分子相互作用。2:2复合物不仅能够被两个DNA结合表面稳定,而还被cGAS二聚化界面稳定。突变分析表明,二聚化的相互作用与两个DNA结合界面对cGAS在产生I型干扰素方面都有着重要作用。对于小鼠和人类的cGAS来讲,DNA的结合会触发高度保守环(残基210-220)的明显构象改变,该环向内移动,重新排列活性位点,用于cGAMP的合成。dsDNA对cGAS的激活具有长度依赖性。含有短链dsDNA(∼20bp)的cGAS复合物是不稳定的,而较长的dsDNA(>45bp)则能与cGAS二聚体形成稳定的梯状网络,从而促进更多cGAMP的产生。有意思的是,当短dsDNA(12-20bp)携带未配对的鸟苷延伸物(Y型DNA)时,此种物质会对cGAS造成强烈的刺激,这种现象可以在HIV来源的ssDNA(含有一个茎环结构)刺激中中发现。

2.3-cGAMP激活STING的第二信使

cGAS以及它的产物cGMAP的发现解释了为什么STING在细胞质DNA和细菌CDNs的刺激下,能介导I型干扰素的产生。随后的研究进一步表明,cGAS产生的内源性cGAMP含有混合磷酸二酯键,一个磷酸二酯键在GMP的2’-羟基与AMP的5’-磷酸之间,另一个在AMP的3’-羟基与GMP的5’-磷酸之间,它们会形成独特的环状二核苷酸,命名为2’-3’-cGAMP。内源性信使2’3’-cGAMP与STING(Kd~4nM)的结合能力明显高于其它含有磷酸二酯键组合(2’2’-cGAMP,3’3’-cGAMP和3’2’-cGAMP)的cGAMP分子。此外,2’3’-cGAMP比细菌CDN和其他cGAMP异构体具有更强的诱导干扰素β的能力。

当STING不与配体结合时,它会在ER上形成一个蝴蝶样二聚体结构,当2’3’-cGAMP与STING结合时,STING就会发生构象改变。当缺乏配体时,STING二聚体就会形成一个开放结构,两个蝴蝶翅膀就会相互离开。一旦与2’3’-cGAMP结合,这两个翅膀就会相互靠近,配体就会进入其中,同时还伴随着一个在结合口袋上方由四条反向平行的β片状链组成的盖子,从而形成一个封闭的构象。这种结合口袋的改变会重新排列STING二聚体的外段,这可能参与招募I型干扰素途径的下游信号成分。需要注意的是,在针对STING的大多数最初研究中,c-di-CMP的结合并不会诱导明显的STING二聚体的构象改变,这有可能是由于使用了人类STING的功能缺陷的H232突变体进行结晶的。然而,对于野生型R232 STING来说,c-di-GMP会诱导类似于2’-3’-cGAMP的结构变化。但是,由2'3'-cGAMP诱导的,STING二聚体的封闭构象与这一等位基因变异无关。

2’-3’-cGAM在细胞质DNA的刺激下,cGAS产生的2’3’-cGAMP不仅能开启细胞内抗菌的信号转导,而且还会通过至少三条不同的途径传递到周围细胞。第一,在一个细胞中产生的2’-3’-cGAMP通过缝隙连接(gap-junctions)直接转移到相邻细胞,这就是连接相邻细胞质的细胞-细胞接触依赖通道。第二,在感染慢病毒、HSV、MCMV和重组修饰的Ankara痘病毒(modified vaccinia Ankara virus)时,2’3’-cGAMP会被包装新的病毒颗粒,并在下一轮感染时被携带目标宿主细胞中。第三,在HIV感染方面,cGAMP可以从被感染的供体T细胞通过HIV包膜诱导折细胞间膜整合的方式,转移到初级巨噬细胞中。细胞间2’3’-cGAMP扩散被认为是能够为宿主细胞提供更快的先天性免疫保护,尤其是当宿主细胞被编码cGAS拮抗剂的病毒感染时,宿主细胞产生2’3’-cGAMP的这种能力或许就会出现障碍。此外,这种第二信号在细胞间的传递会使邻近未感染的细胞产生干扰素应答,从而避免这些细胞被感染。

STING的转运与信号转导

STING在细胞内的转运在下游信号转导功能方面发挥了重要的作用(图表3)。当cGAMP与STING的结合会诱导一个强烈的STING转运,将STING从ER转移到细胞核周围区室,在那里TBK1与STING共定位。布雷菲德菌素A(Brefeldin A)或志贺氏菌(Shigella)效应蛋白JpaJ能打破ER向高尔基体的转运,阻断STING下游的信号转导。当STING与cGAMP结合时,STING被观察到能部分与多个细胞器共定位,这些细胞器就包括ER-高尔基体中间区室(ERGIC,ER-Golgi intermediate compartments),高尔基体复合物,内体与自噬体。不同的研究团队都认为,每个这样的区室都有STING介导的TK1/IRF3活化位点。然而现在还没有达成一致的结论,即STING是在细胞的哪里被活化的,以及STING活化后转运的机制是什么。

虽然STING活化的细胞生物学机制并不清楚,但是生化的研究表明,STING的C末端对于形成TBK1介导的IRF3有着重要的作用。当cGAMP与STING结合时,STING的构象会发生广泛的构象变化,重构STING C尾部,这或许会将重要的元件暴露出来,这对于STING的转运,TBK1的招募以及其它信号转导事件来说是必需的。最近的研究指出,TBK1介导的IRF3活化是一种普遍的衔接-脚手架机制。尤其是确认了一个共同的pLxIS基序(p表示亲水的,x表示非芳香的,S代表丝氨酸)是一个重要的衔接成分,用于支持TBK1介导的IRF3磷酸化。IRF3上游的三个先天免疫衔接蛋白(TRIF、MVAS和STING)都有这个基序。一旦激活三个衔接蛋白中的任何一个,这一共同的基序就会直接被TBK1(人类的STING在Ser366发生磷酸化)磷酸化,而磷酸化的基序又作为IRF3的停靠位点,促进其被TBK1磷酸化,从而导致IRF3二聚化和激活。由Unc-51-样激酶1(ULK1,酵母中是Atg1)在Ser366位点介导的STING磷酸化被认为是能抑制STING的信号转导,但是这种却与其它的研究有矛盾,其他的研究表明,由TBK1介导的在同一位点的磷酸化参与IRF3的活化以及干扰素的产生。在一个分子动力学仿真模型中,cGAMP结合并诱导的STING的盖子结构为STING的C-末端尾部提供了一个锚点,使其具有合适的构象,便于被TBK1磷酸化。此模型有数据支持,这些数据显示,一个假设的帽子:C尾部相互作用位点的点突变会导致I型干扰素的产生出现障碍。然而,TBK1是如何被招募,并被STING和cGAMP结合所活化的,还不清楚。

细胞质DNA的识别在抗菌自噬方面的作用

除了产生干扰素外,大量的证据表明cGAS-STING通路也能诱导自噬。DNA能刺激STING通过高尔基体转运到内体样区室中,在这里,STING不仅与TBK1共定位,并且还会与自噬相关蛋白9(ATG9)和微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)共定位,LC3是一个自噬小体形成的标记物。当用DNA病毒,例如HSV-1和HCMV感染时,能诱导人胎儿包皮成纤维细胞(Human fetal foreskin fibroblasts)中强烈的LC3脂化,使用电穿孔传递DNA也有类似的现象。HSV-1诱导的LC3脂化被发现依赖于病毒的基因组DNA和宿主细胞的STING。类似的,细胞病原体结核分枝杆菌(M. tuberculosis)也能激活依赖于STING的自噬,用于控制胞内菌的复制。细菌的CDN,例如c-di-GMP和c-di-AMP也能诱导自噬。最近,cGAS被发现与识别结核分枝杆菌来源的DNA有关,然后能产生cGAMP,用于激活STING介导的自噬和I型干扰素的产生。因此,除了产生干扰素外,cGAS/STING通路还能触发自噬作为一种细胞自主策略来控制病原体的复制,并能清除由感染诱导的细胞应激。但是,自噬是如何被STING活化的,以及细胞质DNA或病原体是如何被自噬靶向作用的,还需要进一步研究。

AIM2炎性小体通路

在免疫学细胞中,细胞质的dsDNA通过cGAS-STING通路诱导I型干扰素的产生外,它们还能诱导炎性小体的组装,炎性小体是一种多蛋白复合物,它们是caspase-1-依赖的促炎性细胞因子(例如IL-1β)成熟的平台。第一个被发现的炎性小体感受器的基团是NOD样受体(nucleotide oligomerization domain,NOD,NOD-like receptor, NLR),其特征是存在一个NACHT结构域,该结构域参与激动剂识别和自身寡聚。NLRP3是研究得最为广泛的一个NLR之一,它能识别大量的微生物和内源性刺激。但是内化的细菌、病毒和哺乳动物dsDNA都能不依赖于NLRP3激活炎性小体。后来确认了AIM2是一个DNA感受器(图表2)。AIM2是第一个被发现的炎性小体感受器家族成员,AIM2样受体(ALR)中的NLR含有一个或更多的HIN-200结构域,而非NACHT结构域 。

NLRP3通过潜在的中间信号间接地对各种刺激产生应答,AIM2与之不同,AIM2通过直接结合的方式识别dsDNA。AIM2的C末端HIN-200结构域通过主要与次要凹槽同时与dsRNA的两条链结合,这就解释了为什么AIM2能对dsRNA,而不是ssDNA进行应答。AIM2的相互作用是由dsDNA的糖-磷酸骨架介导的,这与DNA非序列依赖识别方式是一致的。AIM2与cGAS类似,AIM2缺少序列偏爱性,这种特征或许就使得AIM2能检测各种入侵的微生物。

NORs与ALRs都含有pyrin结构域(PYD),此结构域介导共同的下游衔接蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)的N末端PYD的同型相互作用(图表4)。ASC随后会经历类似朊病毒样聚集,招募半胱氨酸蛋白酶caspase-1,从而导致caspase-1的自切割和激活。活性caspase-1促进IL-1β和IL-18的成熟。caspase-1也能裂解Gasdermin D,然后在细胞膜上形成孔隙,从而引起细胞焦亡(pyroptosis)。


微生物逃避宿主核酸的识别

随着对抗感染的各种先天性免疫系统在多细胞生物中的进化,微生物病原体也进化出了相应的逃避或攻击宿主免疫的策略。这对于大多数致微生物来说必须这样,否则它们就不会造成宿主的疾病就会被清除。在最近的几年内,人们已经发现了许多微生物进化而来的,逃避核酸识别的机制。在下面的部分中,我们会讨论一些代表性的病原体所利用的不同逃避机制。


降解、隐藏、修饰微生物的核酸

由于先天性免疫系统对入侵微生物识别的第一步就是识别各种PAMP,因此隐藏微生物的PAMP,尤其是隐藏核酸是微生物进化出来的,一种逃避宿主攻击的常规策略。一种有效的隐藏核酸而不被TLR识别的方法就是从内体区室中逃逸,就像许多病毒和细菌一样,其中一些仅仅通过直接入侵细胞质就会绕过内吞过程(endocytic process)。一种避免细胞质识别的方法就是通过降解来清除微生物的核酸。哺乳动物的细胞可以编码多种核酸酶,用于降解细胞内和细胞外的DNA。例如,核酸酶TREX1降解能ssDNA或对dsDNA形成缺口,而该酶则会被HIV劫持,用以避免细胞质中病毒DNA的积累,以及逃避cGAS的识别。

除了降解DNA外,病毒还会通过各种物理方法隐藏它们的核酸。例如,除了TREX1介导的DNA降解外,HIV的病毒衣壳还能招募宿主因子来隐藏病毒DNA,使其不会暴露在细胞质中。埃博拉病毒(Ebola virus)使用它自己的结构蛋白VP35,通过直接与RNA结合的方法来隐藏病毒RNA。登革病毒(Dengue virus)通过另一种更复杂的方法达到此目的,具体就是将其dsRNA隐藏在感染后形成的ER来源的囊泡中,这是一种潜在的破坏细胞质中RNA识别的策略。

另一种策略是对微生物核酸进行特定的修饰,避免被宿主的感受器所识别。由于RIG-I识别5’-二磷酸或5’-三磷酸RNA,一些RNA病毒将其基因组中的5’个磷酸水解成5’个单磷酸酯,从而避免被RIG-I识别。真核生物的mRNAs在5'的帽子结构上会出现核酸2’-O-甲基化,这是一种自我识别结构,使真核生物的mRNA不被RIG-I,MDA5和IFIT-1所识别。但是,病毒也能利用病毒的酶或宿主的酶来甲基化他们的mRNA,避免被宿主的免疫系统识别。

对抗核酸感受器

微生物病原体除了在核酸本身方面使用策略外,它们还可以干扰宿主细胞对核酸的识别过程,即直接或间接攻击宿主的核酸感受器。例如,甲流病毒就能靶向作用于RIG-I和E3连接酶TRIM25,阻断多聚泛素化过程与RIG-I的活化。类似的,副粘病毒的V蛋白可以直接结合MDA5,阻断其它细丝的形成。最近,有文献报道了直接靶向作用于cGAS的病毒策略。卡波济肉瘤疱疹病毒(Kaposi sarcoma herpesvirus,KSHV)编码的潜伏期相关核抗原的一个截短的异构体能与cGAS相互作用,并阻止下游信号的活化。KSHV被膜蛋白ORF52及其同源物通过直接与cGAS和DNA结合来抑制cGAS活性。尽管登革病毒能成功地将病毒RNA隐藏在ER来源的囊泡中,造成宿主DNA从损伤的线粒体中释放出来,从而被cGAS识别。但是,登革病毒还能通过病毒蛋白NS2B介导的对cGAS的降解来对抗DNA传识别。

对抗信号转导衔接蛋白和其它信号转导分子

由于核酸识别通路激活了几种常见的衔接蛋白和类似的信号级联反应,许多病原体已经进化出了针对信号衔接蛋白和下游分子的策略。在许多情况下,宿主衔接蛋白被病毒蛋白酶介导的裂解直接破坏。例如,HCV蛋白酶NS3/4A通过直接将MAVS从线粒体膜上切割下来,用于制MAVS信号转导。类似地,柯萨奇病毒B(Coxackievirus

B)的半胱氨酸蛋白酶3C和甲型肝炎病毒的3C蛋白酶前体都能切割TRIF和MAVS,从而抑制宿主干扰素的产生。

有些病毒通过直接结合而不是切割来抑制衔接蛋白的功能。一种由痘病毒(poxvirus)编码的PYD蛋白M13L能与AsC相互作用,抑制炎性小体的活性。KSHV是一种γ疱疹病毒亚科,它编码6种病毒蛋白,通过cGAS-STING途径阻断干扰素-β的激活。其中,病毒干扰素调节因子1(viral

Interferon Regulatory Factor 1,vIRF1)与TBK1相互作用,导致STING磷酸化以及下游信号转导出现障碍。两种DNA肿瘤病毒,即人乳头状瘤病毒(HPV,human papilloma virus)和腺病毒(adenovirus)也能通过其癌基因产物攻击cGAS途径。来自HPV的E7和腺病毒的E1A有一个共同的LxCxE基序,其中x是指任一氨基酸,它能直接与STING结合,抑制宿主的抗病毒信号转导。

许多微生物病原体能干扰核酸识别器和衔接蛋白的下游信号转导。例如,如上文所述,志贺氏菌(Shigella)效应蛋白IpaJ通过阻断STING从ER的转运来抑制抑制STING信号转导。HSV-1 ICP27与活化的STING-TBK1复合物结合,阻断下游的IRF3磷酸化,而VACV蛋白K7能靶向作用于 DEAD box protein 3,抑制TBK1信号转导。参考文献中还列出了最近发现的一些靶向作用于信号转导分子的一些微生物逃逸的案例。

结论和未来展望

在理解先天性免疫识别微生物核酸方面,人类已经取得了巨大的进步。细胞质中RNA感受器和DNA识别器,以及内体中的TLRs,构成了宿主的多层监测体系,微生物的核酸一旦触发这个体系,就会诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的产生。生物化学、遗传学和结构学的研究已经阐明了各种病原体感染的特异性核酸识别和抗菌信号转导的分子机制。未来的研究将需要解决多个核酸识别通路是如何被调控的,以及它们是如何协作用于诱发一个优化的免疫应答的。不同病原体和它们相应的核酸感受器之间必然存在着更明确的联系。随着成像技术的发展,在活细胞感染过程中,微生物的核酸感受器和它们的相应配体之间的直接和动态的相互作用是可以被观察到的。

在了解每个核酸识别器途径的细胞生物学调控方面还有更多的工作要做。例如,虽然TLRs和STING都会进行大量的细胞内转运,但是其中的分子机制仍然不清楚。目前还不清楚,STING离开了高尔基复合物后会发生什么。STING是如何激活自噬的?MAVS和STING信号转导关闭的机制是什么?如果能够回答这些问题,那么人类就能更好地理解这些途径是如何在细胞中被调控的。

尽管人类最初发现先天性免疫途径是对抗微生物感染的,但在不同的生理和病理条件下,自身的DNA或RNA也触发核酸识别和信号转导。后者的这种现象可能会导致严重的后果,例如自身免疫性和自身炎症性疾病。另一方面,cGAS-STING通路对肿瘤DNA的识别也是抗肿瘤免疫的一个重要内容。此外,最近有人证明,cGAS通路在细胞衰老(cellular senescence)和由细胞核DNA损伤或染色体错误分离引起的炎症方面,也有着重要的作用。因此了解核酸感受器是如何有效地检测病原体感染,同时避免引发自身核酸造成的自身免疫反应方面有着和重要的意义。这样的知识在开发针对传染病、自身免疫性疾病、衰老相关疾病和癌症的安全有效的新疗法时,也有着重要的价值。

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