文章信息
文章题目：Burn-Induced Gut Microbiota Dysbiosis Aggravates Skeletal Muscle Atrophy by Tryptophan-Kynurenine Mediated AHR Pathway Activation
发表期刊：Advanced Science
影响因子：14.3
团队：武汉大学人民医院麻醉科高珊、夏中元、雷少青团队
研究背景
烧伤是临床上常见且严重的创伤，大面积烧伤患者常伴有严重的骨骼肌萎缩，极大影响康复进程与生活质量。然而，目前对于烧伤后骨骼肌萎缩的潜在机制，尚未完全明确。近年来，越来越多研究表明肠道微生物群在维持机体健康方面发挥着关键作用，其与宿主的代谢、免疫调节等密切相关，且肠道微生物群的失调被发现与多种疾病的发生发展有关。但肠道微生物群在烧伤诱导的骨骼肌萎缩过程中扮演何种角色，以及背后潜在的分子机制如何，仍有待深入探究。在这样的背景下，开展对烧伤后肠道微生物群与骨骼肌萎缩关系的研究具有重要意义，有望为改善烧伤患者骨骼肌健康提供新的治疗策略与方向。百易汇能提供了本文16S rRNA和代谢组测序服务。
技术路线
研究结果
1 烧伤导致骨骼肌萎缩并伴有肠道菌群失调
在一个体表面积（TBSA）30% 的三度烧伤模型中，胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）和腓肠肌（GAS）的相对重量显著降低（图 1A）。烧伤大鼠的 TA 肌纤维横截面积（CSA）也显著减小（图 1B），MAFbx和MuRF - 1的表达增加（图 1C），这些结果表明出现了骨骼肌萎缩。
随后，作者通过对 16S rRNA 基因进行测序，分析了烧伤对肠道菌群的影响。α 多样性分析显示，烧伤并未改变肠道菌群的多样性。然而，β 多样性分析（PCoA）表明，烧伤组的粪便微生物群落组成发生了显著变化（图 1D）。作者进一步分析了肠道微生物在门和属水平的相对丰度。具体而言，Firmicutes 和Bacteroidetes在假手术组和烧伤组中均占主导地位，而Verrucomicrobia和 Proteobacteria在烧伤组中更为丰富（图 1E）。对烧伤组最富集的前 20 种细菌进行lefse分析，Proteobacteria–Gammaproteobacteria–Enterobacteriales–
Enterobacteriaceae–Escherichia-Shigella对烧伤大鼠肠道菌群差异的贡献最大（图 1F）。值得注意的是，烧伤大鼠的Proteobacteria 和Escherichia-Shigella的相对丰度显著增加，而 Alloprevotella 属的相对丰度略有下降（图 1G）。进一步分析表明，烧伤引起的肠道菌群变化与肌肉重量（TA/EDL/GAS）呈负相关，具体而言，Proteobacteria的相对丰度与肌肉重量呈负相关。这些发现表明，烧伤改变了肠道菌群的组成。
2 肠道微生物群改变导致烧伤诱导的骨骼肌萎缩
为了探究肠道微生物群改变在烧伤诱导的骨骼肌萎缩中的作用，作者首先按照图 2A 所示的方案建立了抗生素伪无菌模型。大鼠接受抗生素Abx治疗 1 周，以耗尽共生肠道微生物群。这些微生物群耗尽的大鼠烧伤诱导的骨骼肌萎缩减轻，表现为肌肉（TA、EDL 和 GAS）重量和肌纤维 CSA 的损失减少（图2B、C），以及萎缩标记物 MAFbx 和 MuRF-1 的表达降低。
然后，作者建立了粪便微生物群移植（FMT）模型（图2D），以证实肠道微生物群异常诱导的骨骼肌萎缩。FMT 30 天后，接受烧伤大鼠粪便的受体大鼠结肠中Firmicutes, Bacteroidetes, Ver-Rucomicrobia、Proteobacteria和菌属Escherichia-Shigella 丰度增加。值得注意的是，LEfSe 分析显示Escherichia-Shigella仍然是这些受体大鼠（烧伤 - FMT 组）中富集的优势菌属（图2E），这些大鼠的骨骼肌重量和肌纤维 CSA 减少，MAFbx 和 MuRF-1 的表达增加（图2F、G）。这些发现证实，改变的肠道微生物群，特别是Proteobacteria和菌属Escherichia-Shigella丰度的增加，导致了烧伤诱导的肌肉萎缩。
3 烧伤改变肠道微生物群相关的色氨酸代谢谱
作者使用LC - MS探究了粪便微生物代谢物。 PCA结果显示，假手术组和烧伤组之间的代谢物具有良好的质量控制和明显的区分度（图 3A）。在正离子模式下，烧伤大鼠粪便中有 34 种代谢物上调，102 种代谢物下调（图 3B）。对这些代谢物进行KEGG富集分析，结果显示有四条富集途径，其中色氨酸代谢途径主要参与骨骼肌重量的调节（图 3C）。色氨酸代谢通过三条途径进行：由 IDO - 1 促进的犬尿氨酸途径、血清素途径和吲哚途径（烧伤大鼠中更倾向于转化为色氨酸 - 犬尿氨酸途径）。此外，作者检测了血清和骨骼肌中的色氨酸代谢谱，发现与吲哚或血清素途径相关的代谢物没有差异。对色氨酸衍生代谢物的定量分析显示，烧伤大鼠粪便中色氨酸水平降低，N - 甲酰犬尿氨酸（N - Kyn）和犬尿氨酸水平升高，犬尿氨酸与色氨酸的比率（主要色氨酸降解酶 IDO - 1 活性的指标）升高（图 3D）。然而，犬尿喹啉酸（KynA）与犬尿氨酸的比率（犬尿氨酸转氨酶活性的指标）降低。总之，这些结果表明，烧伤通过犬尿氨酸途径重新编程了色氨酸代谢。
作者对色氨酸衍生代谢物和差异肠道菌群（lefse分析的差异菌群）进行了皮尔逊相关性分析。烧伤诱导的肠道菌群Proteobacteria–Gammaproteobacteria–Enterobacteriales–Enterobacteriaceae–Escherichia-Shigella的变化与 N - Kyn 和犬尿氨酸的浓度以及 Kyn/Trp 比率呈正相关（图 3E），这表明Proteobacteria的改变与色氨酸1代谢密切相关。
4 肠道菌群失调诱导的骨骼肌中色氨酸 - 犬尿氨酸代谢失调归因于结肠 IDO - 1 的过度激活
如图 4A 所示，色氨酸通过犬尿氨酸途径的代谢由限速酶 IDO - 1 介导，产生犬尿氨酸及其下游产物。为了评估改变的肠道菌群对色氨酸衍生代谢物水平的潜在影响，作者对血清和骨骼肌进行了HPLC - MS/MS分析。在烧伤大鼠的血清中，色氨酸和 N - Kyn 水平显著降低，同时 KynA 水平升高。烧伤大鼠的骨骼肌也表现出 N - Kyn 水平降低和犬尿氨酸水平升高（图 4B），但色氨酸水平保持不变，这可能是由于骨骼肌蛋白分解为氨基酸以满足烧伤伤口愈合的需求。此外，相关性分析表明，肌肉犬尿氨酸水平与肌肉重量（TA、EDL 和 GAS）呈负相关。
IDO - 1 不仅在结肠中表达，在血清和骨骼肌中也有少量表达。在肌肉组织中积累的犬尿氨酸可能通过SLC38A2转运到骨骼肌细胞中。此外，骨骼肌细胞通过色氨酸代谢促进犬尿氨酸的产生。
为了阐明肌肉中犬尿氨酸的来源，作者检测了结肠、血清和骨骼肌中 IDO - 1 的表达。免疫荧光（IF）染色显示，烧伤大鼠结肠中 IDO - 1 阳性细胞数量增加（图 4C）。进一步分析证实，烧伤大鼠结肠中 IDO - 1 表达上调，而血清和骨骼肌中的水平没有显著变化（图 4D，E）。这些结果共同表明，骨骼肌中增加的犬尿氨酸主要来源于结肠 IDO - 1 催化的色氨酸产生，而不是骨骼肌内的色氨酸代谢。
为了进一步证实结肠 IDO - 1 对骨骼肌的影响，作者使用巴马汀（Pal），一种有效的 IDO - 1 抑制剂，来抑制烧伤大鼠中 IDO - 1 的活性（图 4F ）。巴马汀有效地抑制了结肠中 IDO - 1 的表达，并逆转了烧伤诱导的肌纤维 CSA 减小（图 4G）和肌肉（TA、EDL 和 GAS）重量降低（图 4H），这表明抑制结肠 IDO - 1 可以减轻烧伤诱导的骨骼肌萎缩。这些发现表明，肠道菌群促进色氨酸向犬尿氨酸的程序化代谢，加剧了烧伤后的骨骼肌萎缩。
5 肠道菌群对于烧伤诱导的骨骼肌中异常的色氨酸代谢至关重要
作者在抗生素伪无菌模型和 FMT 模型中进一步证实了改变的肠道菌群在结肠 IDO - 1 介导的骨骼肌色氨酸 - 犬尿氨酸代谢紊乱中的作用。用 Abx 处理耗尽共生肠道菌群后，假手术组和烧伤组大鼠的血清或骨骼肌中色氨酸 - 犬尿氨酸代谢物除了 KynA 水平降低外，没有显著变化（图 5A，B）。此外，结肠、骨骼肌或血清中 IDO - 1 的表达也没有显著变化（图 5C - E）。然而，FMT 30 天后，接受烧伤大鼠粪便的受体大鼠血清和骨骼肌中的色氨酸水平显著降低，骨骼肌中的犬尿氨酸水平升高（图 5F，G），这与烧伤大鼠骨骼肌中犬尿氨酸的升高一致（图 4B）。此外，接受烧伤大鼠粪便的受体大鼠结肠中 IDO - 1 的表达高于接受假手术大鼠粪便的受体大鼠。两组之间骨骼肌和血清中 IDO - 1 的表达没有显著差异（图 5H - J）。总体而言，这些发现突出了改变的肠道菌群在介导烧伤后骨骼肌中异常色氨酸 - 犬尿氨酸代谢中的关键作用，主要是通过上调结肠中的 IDO - 1。
6 犬尿氨酸通过激活 AHR 途径诱导 L6 肌管中的蛋白水解
L6 成肌细胞分化为肌管，苏木精和伊红染色显示，暴露于犬尿氨酸后，肌管直径和长度呈剂量依赖性减少（图 6A，B）。考虑到 SLC38A2 和 AHR 可以在 L6 肌管中表达，并且 SLC38A2 是在骨骼肌中始终存在的唯一氨基酸转运体，作者检测到在犬尿氨酸处理 24 小时后，SCL38A2 和 AHR 的 mRNA 和蛋白质水平显著增加（图 6C）。这伴随着肌管长度的减少和 AHR 表达的上调，而 SLC38A2 的敲低显著减弱了这种情况（图 6D，E）。为了研究犬尿氨酸与 AHR 细胞内结合触发的细胞信号级联反应，作者在肌管中进行了共免疫沉淀（COIP）测定，结果显示 AHR 与HSP90共免疫沉淀，但不与 Cul4B共免疫沉淀（图 6F）。作者进一步验证了 AHR 在肌管萎缩中的作用。AHR 的敲低减轻了犬尿氨酸诱导的萎缩，表现为肌管直径和长度的增加（图 6G）。此外，AHR 的敲低减弱了犬尿氨酸诱导的 CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、MAFbx 和 MuRF - 1 表达的上调，以及犬尿氨酸诱导的 AHRR 表达的下调（图 6H，I）。这些发现表明，犬尿氨酸通过 SLC38A2 介导的细胞进入，与 AHR 结合来调节肌管萎缩。
7 烧伤患者的色氨酸代谢紊乱
作者还研究了烧伤患者的色氨酸代谢物。表 S1（补充信息）展示了烧伤患者和健康志愿者的一般情况。观察到烧伤患者第三腰椎骨骼肌指数显著降低。HPLC - MS/MS 分析表明，烧伤患者血清中的色氨酸显著降低，同时 N - Kyn 和 3 - 羟基邻氨基苯甲酸水平降低，5 - 羟基吲哚乙酸水平升高（图 7），这表明烧伤导致了色氨酸代谢紊乱。
8 富含色氨酸的饮食改善烧伤大鼠的骨骼肌萎缩
为了确定补充色氨酸是否可以改善烧伤诱导的肌肉消耗，大鼠被喂食富含色氨酸的饮食 7 天（图 8A）。在接下来的 7 天补充 PBS 或色氨酸后，色氨酸逆转了烧伤诱导的骨骼肌萎缩，表现为与 Ctrl - burn 组相比，Trp - burn 组的肌纤维 CSA 和肌肉重量增加（图 8B，C）。此外，色氨酸补充上调了结肠中 AHR 和 IDO - 1 的表达水平（图 8D）。这些发现表明，补充色氨酸可以预防烧伤后因肠 - 肌轴功能障碍导致的肌肉质量损失。
研究结论
本文通过多项实验研究，揭示了烧伤后肠道菌群、色氨酸代谢、AHR 信号通路与骨骼肌萎缩之间的关系。研究发现，烧伤诱导的肠道菌群失调会加剧骨骼肌萎缩，其机制为肠道菌群紊乱使结肠 IDO-1 表达上调，促进色氨酸向犬尿氨酸代谢，导致血清和骨骼肌中色氨酸减少、犬尿氨酸增加。过量的犬尿氨酸经血液循环进入骨骼肌细胞，与 AHR 结合，激活 AHR 通路，进而启动骨骼肌萎缩相关基因的转录。
此外，研究还表明烧伤患者存在色氨酸代谢紊乱，补充色氨酸能有效缓解烧伤大鼠的骨骼肌萎缩情况。这一发现不仅加深了人们对骨骼肌病理途径的理解，而且为通过调节肠道菌群 - 色氨酸代谢轴来维护骨骼肌健康开辟了新方向，有望为烧伤患者骨骼肌萎缩的治疗提供新的策略和理论依据。
