CDT1 Is a Novel Prognostic and Predictive Biomarkers for Hepatocellular Carcinoma

CDT1是一种新的肝细胞癌预后和预测生物标志物

发表期刊：Front Oncol

发表日期：2021 Sep 24

DOI:  10.3389/fonc.2021.721644

一、背景

        肝细胞癌（HCC）是一种发病率和死亡率都很高的严重疾病，每年在全世界造成50多万人死亡。HCC通常由慢性肝炎症演变而来，其中80%是由病毒性丙型或乙型肝炎引起的。HCC的高转移率和高复发率给诊断和治疗带来了重大挑战。

        保持基因组的完整性需要对DNA复制进行严格和精确的调控，它需要与其他细胞事件协调，以确保每个细胞周期只发生一次。染色质授权和DNA复制因子1（CDT1）对DNA复制的启动是不可或缺的，它在真核细胞复制和细胞周期调节中起着关键作用。真核细胞周期中对DNA启动的控制需要多个蛋白复合物之间的协调。最近的研究报告指出，一些异常的DNA复制和不受控制的细胞周期进展可能归因于CDT1的失调，它的破坏性作用已经在一些类型的肿瘤的启动、发展和化疗抗性中被发现。

二、材料与方法

1、数据来源

1）TCGA-LIHC：包括 374 个LIHC 样本和 50 个癌旁组织

2）从UCSC Xena 获取TCGA 和基因型组织表达 (GTEx) 中 33 种肿瘤的正常RNA-Seq 数据

3）GSE14520 (HCCDB6) 和 ICGC-LIRI-JP (HCCDB18) 数据集

4）正常人肝细胞系（L-02 细胞）和 HCC 细胞系（Hep3B、LM3 和 SMMC-7721）购自中国细胞库（中国上海）

5）人 HCC 组织芯片（货号 IWLT-N-64LV41）购自武汉赛维尔生物科技有限公司（中国武汉），包括 14 个 HCC 组织样本和配对的非肿瘤组织样本

2、分析流程

流程图

三、实验结果

01 - CDT1表达的泛癌症分析

        作者利用不同来源的独立数据集研究了CDT1在不同类型癌症中的表达水平。首先，在TCGA和GTEx数据集中研究了各种人类癌症及其对应的正常组织中CDT1的转录水平。对于多种癌症，包括乳腺浸润癌和胃腺癌，CDT1在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织（图2A , B）。然后用ONCOMINE评估了泛癌的CDT1表达水平，显示了与上述相同的表达趋势（图2C）。此外，对CCLE数据库中多个常见癌症细胞系的CDT1表达水平的分析表明，肝癌细胞的CDT1表达相对高于其他肿瘤细胞（图2D）。

图2 CDT1在不同类型癌症中的表达水平

        作者利用TCGA数据来比较HCC癌症样本和正常样本之间CDT1的转录水平。相对于正常肝脏样本，HCC样本中CDT1的mRNA表达水平明显增加（图3A），这一结论在配对的HCC和正常组织中也得到了验证（图3B）。还比较了HCCDB数据集中HCC样本和正常对照样本之间CDT1的转录水平，这表明HCC中CDT1表达异常高（图3C）。同样的结论在ONCOMINE数据中得到进一步证实。Roessler和Wurmbach数据集表明，CDT1在HCC组织中相对于正常组织是上调的（图3D , E）。此外，根据HPA数据集，在HCC组织中观察到高的CDT1蛋白表达（图3F）。对HCC组织芯片的IHC染色结果表明，HCC组织中CDT1的表达明显高于配对的相邻非肿瘤组织。使用配对t检验的配对散点图的结果见图3G。最后，通过对一个正常人肝细胞系和三个HCC细胞系的qRT-PCR和Westernblot分析，验证了CDT1在正常和HCC细胞中的表达差异（图3H , I）。

图3 CDT1在HCC的细胞和组织水平上的相对表达

02 - CDT1的mRNA水平与HCC患者的临床病理特征的关系

        使用UALCAN评估CDT1的表达与HCC患者的临床病理特征之间的关系，包括临床癌症分期、病理肿瘤分级、患者年龄和TP53突变状态。癌症晚期的HCC患者的组织中CDT1 mRNA的表达水平往往较高，CDT1的最高mRNA水平主要出现在II期和III期的患者身上（图4A）。根据病理肿瘤分级标准，高等级肿瘤患者往往表现出更高的CDT1的mRNA水平（图4B）。主要在41-60岁年龄组发现CDT1的明显高表达（图4C）。在TP53变异组与正常组和TP53非变异组之间发现了CDT1表达的明显差异（图4D）。此外，CDT1的表达与性别、种族、病理分期、T期和甲胎蛋白水平有明显关系。

        Logistic回归分析表明，CDT1的表达与各种预后不良的临床特征密切相关，如病理分期，T期，甲胎蛋白，和组织学分级。此外，还评估了各种生存参数与HCC患者CDT1 mRNA水平的关系。生存分析表明，CDT1高表达的HCC患者的OS、PFS、RFS和DSS率明显低于CDT1低表达的患者（图4E-H）。使用HCCDB上的GSE14520（HCCDB6）和ICGC-LIRI-JP（HCCDB18）数据集进行进一步的生存分析，得到了同样的结论（图4I , J）。还评估了不同年龄和TNM分期的HCC患者中CDT1表达对OS的影响（图4K）。作者根据RNA-Seq数据和TCGA数据集的临床信息，用Cox比例风险回归分析评估了CDT1的独立预后价值。结果表明，CDT1的高转录水平与HCC患者的OS和DSS显著缩短独立相关。CDT1的转录水平被证实是HCC患者OS和DSS的一个独立预后因素。

图4 CDT1表达与HCC患者临床参数的相关性及其预后意义

        ROC曲线分析表明，CDT1在HCC的诊断中具有很强的价值（图5A）。接下来，作者评估了CDT1表达对HCC患者不同临床特征的诊断价值。具体来说，AUC值为：I/II期为0.969，III/IV期为0.975，T1/T2期为0.969，T3/T4期为0.975，N0期为0.976，M0期为0.972，G1/G2期为0.960（图5B -H）。此外，建立了一个结合CDT1表达和关键临床因素的nomogram来预测HCC患者的1年、3年和5年的生存率。OS的nomogram得分越高，表明预后越差（图5I）。这些结果意味着CDT1的转录水平对HCC的诊断是相对敏感和特异的。

图5 CDT1 mRNA水平对HCC的诊断价值

03 - 识别差异表达的基因、富集分析

        为了探索CDT1高表达引起的下游通路的异常变化，作者鉴定了TCGA-HCC数据集中高CDT1和低CDT1表达样本间的DEGs。在总共3755个DEGs中，有2873个上调，882个下调。火山图和柱状图来直观地显示DEGs的分布（图6A , B），热图描述了CDT1-high和CDT1-low表达组之间前15个明显上调和下调的DEGs（图6C , D）。

图6 HCC样本中CDT1-high和CDT1-low表达的DEGs的火山图和热图

        作者进行了GO和KEGG富集，以预测前15个上调和下调的CDT1相关DEGs的功能和途径（图7A）。KEGG富集的结果显示了几个主要途径：细胞周期、DNA复制和同源重组（图7B）。

图7 富集分析

        此外，通过HCCDB数据库的"HCC元共表达网络 "功能，获得了在HCC中与CDT1表达模式相似的基因，并对这些共表达基因（MCM2, MCM10, CDCA5,CDC45, TEDC2, GINS2等）进行了进一步的富集分析（补充图1A）。CDT1相关共表达基因的GO和KEGG富集结果与上述相似（补充图1B，C）。使用GSEA进一步分析CDT1相关的DEGs，以确定在HCC中明显富集的信号通路。根据归一化的富集分数，DNA复制、DNA修复、原基有丝分裂、细胞衰老和癌症中的通路被明显富集（图7C -H）。所有上述富集的通路都与恶性肿瘤的发生和发展有明显的关系。

补充图1 CDT1及其共表达基因的富集分析结果

04 - CDT1在HCC中的分子相互作用

        通过检测GEPIA中的相似基因功能，确定了HCC患者中表达模式与CDT1相似的基因，构建了一个PPI网络来阐明CDT1和具有类似功能的基因之间的潜在相互作用（图8B）。CDT1和与其相似的基因（如KIFC1、RNASEH2A、MCM2、E2F2和CCNF）与DNA复制起源结合、螺旋酶活性、DNA结合、核酸结合和MCM复合物有关。作者还构建了一个PPI网络来探索CDT1与其共同表达的基因之间的相互作用，CDT1相关共表达基因的相互作用网络主要与细胞周期和DNA复制有关。此外，基因-基因相互作用网络还证实，CDT1及其相关基因主要与DNA复制、DNA依赖性DNA复制、DNA链延伸和MCM复合体有关（图8A）。从相互作用分析结果来看，发现CDT1和MCM家族基因在HCC中存在相关性。热图描述了MCM家族基因在HCC样本中的表达，CDT1高表达和CDT1低表达（图8C）。使用Spearman相关分析得到的散点图表明，除了MCM9，MCMs与CDT1在转录水平上高度相关（图8D-G）。

图8

        作者进一步利用TCGA数据来比较HCC癌症样本和正常样本之间MCMs的转录水平。结果表明，除MCM9外，所有MCM家族基因的mRNA表达水平在HCC组织中都明显高于正常组织和配对组织（图9A，B）。此外，除MCM9外，MCMs的高表达与较短的OS明显相关（p< 0.001）（图9C-J）。研究表明，MCMs与CDT1有密切关系，它们在HCC患者中的表达和预后意义，这表明CDT1和MCM家族基因合作促进HCC的发生和发展的潜在机制。

图9

05 - CDT1的表达与各种免疫浸润的相关性分析

        通过探究HCC微环境中各种免疫细胞的浸润，作者发现CDT1的表达与T辅助2（Th2）细胞、活化树突状细胞和T滤泡辅助细胞等免疫细胞的丰度呈正相关，但与中性粒细胞、树突状细胞、细胞毒细胞和肥大细胞等先天免疫细胞的丰度呈负相关（图10A-G）。此外，用TIMER的Cox比例风险回归分析评估了免疫细胞浸润和CDT1表达的独立预后价值。结果表明，除中性粒细胞外，CDT1的表达和所有六种免疫细胞的浸润程度都与OS明显缩短独立相关（Table 3）。

图10 使用TIMER数据库的CDT1表达和免疫细胞浸润情况

06 - CDT1基因敲除抑制HCC细胞，而过量表达促进HCC细胞体外致瘤性

        作者进一步验证了CDT1在HCC体外的作用。由于CDT1在LM3和Hep3B细胞系中的表达高于其他细胞系（图3H），所以选择它们进行功能分析。用siRNA敲除CDT1的干扰效率是用western blot检测的（图11A）。CCK-8和菌落形成实验的结果表明，CDT1敲除明显抑制了LM3和Hep3B细胞的增殖和侵袭能力（图11B , F-H）。此外，伤口愈合和转孔实验表明，CDT1敲除明显抑制了HCC细胞的迁移（图11C -E）。通过进行过表达研究，进一步研究了CDT1的功能。

图11 沉默CDT1可抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭

        通过Western blotting检测CDT1在LM3和Hep3B细胞系中过表达的效率（图12A）。与敲除实验一致，CCK-8、菌落形成、伤口愈合和转孔实验的结果显示，CDT1的过表达明显促进了HCC细胞的增殖、侵袭和迁移（图12B -E）。

图12 CDT1的过量表达促进了HCC细胞的增殖、迁移和侵袭

四、结论

        作者全面系统地评估了CDT1在HCC发生和发展中的表达模式、预后和诊断价值以及潜在机制。本研究结果提供了新的见解，有助于确定新的预后生物标志物和治疗目标，这可能有助于临床医生更准确地预测HCC患者的生存期，并为他们的治疗决策提供依据。