细胞核内基因组的三维（3D）结构对基因表达调控具有至关重要的作用。由特定蛋白质介导的长距离（>20kb）DNA-蛋白质相互作用的失调与多种病理表型密切相关。现有解析此类互作的方法，如HiChIP和ChIA-PET，虽能提供有价值的信息，但其高细胞起始量（>50万细胞）、大数据量需求（>1亿测序读数）以及复杂的数据处理流程，极大地限制了其在原代细胞、临床组织样本及稀有细胞群体中的应用。近日，Sati S. 等人在《PLoS Genetics》发表的“HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions”一文，报道了一种名为HiCuT的新技术，为解决上述瓶颈提供了有效方案。

HiCuT技术：核心原理与流程

HiCuT (Hi-C Coupled chromatin cleavage and Tagmentation) 是一种基于转座酶辅助的tagmentation策略，旨在高效、高分辨率地捕获蛋白质导向的长距离染色质互作。其核心流程包括：

1. 细胞双交联与Hi-C 3.0处理： 首先使用甲醛和DSG（disuccinimidyl glutarate）对细胞进行双重交联，以稳定蛋白质-DNA及蛋白质-蛋白质复合物。随后，采用Hi-C 3.0方案，通过DdeI和DpnII双酶切进行染色质消化。
2. 邻近连接： 酶切后的DNA末端被修复、标记（如生物素化，尽管原文中提到HiCuT省略了Hi-C的生物素富集步骤以捕获更多DNA并减少PCR偏好），并在稀释条件下进行连接，使得空间上邻近的DNA片段优先连接。
3. 抗体捕获与pAG-Tn5 Tagmentation： 邻近连接后，细胞核与伴刀豆凝集素A（Concanavalin-A）磁珠结合，然后孵育特异性抗体以捕获与目标蛋白质相关的染色质互作复合物。关键创新在于，随后使用预装载测序接头的pAG-Tn5转座酶进行tagmentation。这一步骤不仅特异性地切割了目标蛋白结合区域的DNA，并同时完成了测序文库片段的接头连接。
4. 文库扩增与测序： Tagmentation产物经PCR扩增后进行高通量测序。
5. 数据分析： 测序数据通过HiC-Pro等流程进行处理，识别信息丰富的有效配对末端标签（paired-end tags）。

HiCuT技术的显著优势

与现有方法（HiChIP、ChIA-PET）相比，HiCuT展现出多方面优势：

• 极低的细胞起始量： 仅需10万个细胞，相较于传统方法的50万细胞起，降低了至少5倍。
• 显著减少的测序深度： 约1200万条测序读数即可获得高质量数据，相较于传统方法的1亿读数，降低了约8倍。
• 高分辨率与低背景信号： HiCuT产生的片段化文库分辨率高，且背景信号极低。这使得数据解读更为直接，对复杂计算处理的依赖性大大降低。研究表明，60-80%的HiCuT互作末端锚定在已知的ChIP-seq峰内。
• 简化数据处理： 由于信噪比高，HiCuT数据通常不需要复杂的loop calling算法或过滤流程即可识别高频染色质接触。文章指出，简单的距离阈值筛选（如20kb-2Mb）即可有效识别长距离互作。
• 高效性： 实验流程耗时缩短约50%。
• 双重信息获取： HiCuT不仅能鉴定长距离互作，还能同时提供高质量的蛋白质-DNA结合（类似ChIP-seq）信息。

实验验证与性能比较

研究团队通过在GM12878细胞中针对CTCF和RNA聚合酶II (Pol2) 进行HiCuT实验，并与已发表的Hi-C、HiChIP及ChIA-PET数据进行了严格比较：

• CTCF互作： 使用10万GM12878细胞进行的CTCF HiCuT实验（汇集3个重复共30万细胞数据进行分析），能够捕获约52%由高深度Hi-C（约1.25亿细胞，65亿读数）鉴定的loops。这一比例与使用200万细胞、产生18倍测序读数的HiChIP方法（42%）相当甚至更优。APA（Aggregate Peak Analysis）分析显示，CTCF HiCuT数据集相较于HiChIP具有更高的中心富集度和APA得分。
• Pol2互作： Pol2 HiCuT（30万细胞数据）捕获了约84%由ChIA-PET（1亿细胞）鉴定的互作，尽管起始细胞量和测序深度分别减少了325倍和约40倍。APA分析同样显示Pol2 HiCuT具有更高的富集度。
• 原代细胞应用： 在10万原代人皮肤角质形成细胞中，利用H3K27ac抗体进行的HiCuT实验成功鉴定约7.6万个长距离互作。结合GWAS数据，HiCuT将725个与皮肤炎症疾病相关的SNPs与潜在候选基因（其中343个互作锚定在基因启动子区）联系起来，并通过基因本体论分析验证了其与皮肤疾病的相关性。此外，对互作锚定区域的基序分析无偏倚地识别出了p63、Fra-2等角质形成细胞关键转录因子。

HiCuT的创新之处与前景展望

HiCuT的成功关键在于几个方面：1) Tagmentation产生高度特异且片段较小的DNA，提高了loop锚定点的分辨率；2) 省略Hi-C生物素富集步骤，减少了PCR偏好，同时并未显著增加噪音（长距离读数比例与HiChIP相似）；3) 基于Hi-C 3.0方案（双交联、双酶切），其检测长距离染色质loops的灵敏度本身就高于早期Hi-C版本。

HiCuT技术的开发，显著拓宽了蛋白质导向的3D基因组学研究的应用范围，使其能够应用于以往难以企及的样本类型，如原代细胞、临床组织样本和稀有细胞群体。它不仅降低了实验成本和对计算资源的高度依赖，还为从功能层面连接遗传变异与疾病易感基因、以及无偏倚地识别细胞特异性调控网络提供了强有力的工具。HiCuT有望成为研究人类遗传学、个性化表观基因组学以及疾病病理生理机制的普适性工具。

image.png

参考文献：
Sati S, Jones P, Kim HS, Zhou LA, Rapp-Reyes E, Leung TH (2022) HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genet 18(3): e1010121. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010121