CLIP-seq结合了实验和测序方法，可以研究某种蛋白质在体内的RNA的结合情况。原理为基于RNA和RNA结合蛋白在紫外线照射下发生偶联，再经过蛋白特异性抗体将其沉淀，回收片段，再经添加接头，PCR扩增，进行高通量测序，最后经过生物信息学方法分析和处理得到相应的结果。本篇文章注重讨论后续的生物信息学处理。
这篇文章总结一下如何从测序得到原始数据到质控以及序列匹配和peakcalling等步骤，目的是得到蛋白质及其结合RNA的对应关系。涉及到的软件有fastx_toolkit（去接头质控）、bowtie（序列匹配）、samtools（生成bam文件）、bamtools（bam文件排序）、bedtools（bed文件）、piranha（peak_calling）等的使用。
首先讨论数据的获取，通常来源于公共数据库的下载，或者是实验所测得。公共数据库可以从多种途径上下，诸如ENA，SRA等。我处理的数据全部从SRA上下载。
下载数据我用的是aspera，aspera是一种高速的文件传输系统，下载速度和质量都比较好，至于安装和编译过程网上均有较详细的教程。https://asperasoft.com/
（双端测序文件通常分成不同FTP，所以下载双端数据需要在文件名加上后缀_1，_2。）
fastx_toolkit: 安装编译网上教程均有，功能为去接头（adaptor），通常需要卡个长度阈值，然后进行质控（这边保留至少80%得分大于20的序列）。用到的命令有Clipper、Quality filter、Collapser。
clipper 用于减去接头，通常根据文章特定信息减去接头，或者根据不同的测序方法减去特定规定的接头序列（ilumina）主要包括5端接头和3端接头。（cutadapt软件也能去接头，根据需要选择）。quality filter用于质量控制，过滤掉质量偏低的序列，collapser用于压缩相同的序列，压缩完后fastq文件格式会转换为fasta格式。
（双端测序去接头主要用cutadapt）
bowtie是一款比较强大的比对软件，比对前通常需要对参考基因组建立一个索引，常用的如hg19的pre-index，bowtie在主页已经有了，可直接下载使用（3个G左右），然后根据需要设置参数选项等等。bowtie适合比对reads较短的序列，bowtie2适合比对较长的reads（大于1000）.Bowtie: An ultrafast, memory-efficient short read aligner
samtools是一个用于操作sam和bam文件的工具合集，功能较多，这里用来将得到的sam文件抓换为bam文件。bamtools可用来对生成的bam文件进行排序，使其符合一定格式，有利于后续的peak calling，若不执行这一步，则在后续peak calling过程中会报错，提示你未对bam文件排序。
bedtools是一款及其强大的软件，具体信息详见官网介绍，这边我们先用其bam转bed，后续还会用到intersect，可以对序列取交集，并根据需要执行不同的输出。bedtools: a powerful toolset for genome arithmetic — bedtools 2.28.0 documentation
piranha是常用于进行peak calling的软件，可以通过调整不同的参数，最终能够得到一部分序列（bed文件）。后续再通过与hg19参考基因组进行取交集，就能得到pc后的序列对应的基因了。
