原文：Thermodynamic model of gene regulation for the Or59b olfactory receptor in Drosophila
摘要
复杂的真核启动子通常包含多个针对不同转录因子（TF）的顺式调控序列。 TF与这些位点的结合方式，以及TF之间以及与RNA聚合酶（RNAp）相互作用的方式，导致了组合问题，而这种组合问题很少得到详细了解，尤其是在不同的表观遗传条件下。本文的目的是建立一个模型，描述嗅觉受体Or59b的主要调控簇如何驱动果蝇中该基因的转录。使用统计热力学方法，该基因的簇驱动表达表示为RNAp结合至启动子区域的平衡概率。使用Or59b表达的实验数据调整模型参数，根据簇对相应结合位点的单个TF的占据概率以及TF和RNAp之间的相互作用规则，计算RNAp平衡概率。该模型正确地再现了由特定位点的各种突变和表观遗传修饰引起的RNAp结合概率的变化。它的一些预言在新颖的实验中也得到了证实。
作者摘要
该论文提出并通过实验验证了一种模型，该模型用于精细编码果蝇嗅觉受体Or59b基因。该模型基于统计热力学理论，该理论迄今主要用于原核生物。为了将其应用于我们更复杂的真核系统，我们进行了大量的“扰动”体内实验（突变，敲除，敲除，表观遗传条件），旨在阐明Or59b主要调控簇的调控规则尽可能详细地驱动基因表达。我们利用以这种方式获得的Or59b顺式调控模块的知识来建立模型并确定其参数。然后在新的表观遗传条件下对模型的预测进行实验性检验。这些新的实验验证了模型的行为并确认了其预测能力。
引言
在不同的多细胞生物中表达遗传密码信息的方式多种多样，取决于广泛的调节机制。这些调节机制决定了在特定条件下，在任何给定时间，哪些基因“打开”，哪些基因“关闭”，从而控制基因表达。这也是为什么某些基因仅在特殊类型的细胞中表达而不是在生物体的每个细胞中表达的原因[1]。基因启动子包含转录因子（TF）可以结合的特定基序，从而使它们能够增强或抑制对细胞内或细胞外信号的转录。然而，TFs组合对其各自基序的作用本身不足以解释基因表达的模式和解释细胞特异性基因调控所需的空间限制[2，3]。辅助机制如协同作用和竞争作用，顺式调控模块，TF同工型，剪接变体和染色质状态对于确定调控密码和空间受限表达是必不可少的[1，3–6]。由于监管机制都是相互交织的，因此随着复杂监管的增加，组合的复杂性也迅速增加，随之而来的是要获得完整的监管过程图片必须执行的实验数量。对于真核生物而言，在模型中捕获如此复杂的转录调控机制是一项艰巨的挑战：仅详细剖析了少数基因调控，并通过实验验证了所得模型（经典示例是果蝇胚胎中的分割网络[7–11]）。
对于原核生物，最常用于模拟转录调控的方法之一是基于统计热力学[12-16]。热力学模型利用统计力学通过RNA聚合酶（RNAp）与目标启动子结合的平衡概率来计算基因表达水平。它们基于两个假设是成比例的[17]。 RNAp在特定启动子上结合的概率是从启动子在各种可能的构型状态下占据的概率集合获得的，这些概率本身是根据TS结合亲和力及其相互作用（协同变构效应，短程抑制等）以及它们在平衡条件下与RNAp的相互作用计算的。当我们尝试使用热力学模型来描述真核生物中的基因调控时，情况变得更加复杂，这不仅是由于多个结合位点导致的组合调控在大小上成比例，而且更重要的是染色质起到的作用[18]。
在任何多细胞生物中，研究最多的基因调控过程之一是嗅觉系统中气味受体（OR）的单基因表达。嗅觉感觉神经元（OSN）选择从基因组中的大型基因库表达单个OR。特定的OR决定了OSN的身份和功能，表达相同受体的神经元将其轴突投射到大脑中的一个小球上，从而创建了功能类别[19]。
果蝇对小鼠和人类而言，单基因OR表达是保守的。大量的实验探索了确保单一OR表达的调节机制。在脊椎动物中，调节是基于染色质状态的变化。在OSN开发过程中，OR被异染色质覆盖，染色质的受限开放诱导了一个OR等位基因的表达。神经元表面的OR活性引起复杂的反馈回路，从而降低了染色质打开的可能性。这种类似选择的模型可以预测单基因OR表达，但该表达在空间上受到非随机限制。指导选择的过程尚不十分清楚。在较小且数值上不太复杂的果蝇嗅觉系统中，与小鼠中的1400个OR相比，61个果蝇的嗅觉系统，遗传筛选和生物信息学研究提出，单基因表达基于TF组合和顺式调控结构，该结构以非随机的预定过程调节OR表达。但是，TF的表达并不局限于表达受调控的OR的OSN，而且TF结合的基序在基因组中很常见，这表明TF组合不是在果蝇中产生空间受限的OR表达的单一机制。
我们以前已经通过基因研究了果蝇中单基因Or59b表达背后的机制。我们生成了驱动OR59b表达的调节事件的体内定性描述，该描述源自大量实验。遗传筛选显示Or59b表达受三个TF驱动：Acj6，Fer1和Pdm3。 Acj6和Pdm3是Pou-Homeobox蛋白。它们具有两个亚基，每个亚基都可以识别两个不同的DNA核心基序（及其变体）之一，称为Homeobox域（AATTA [20，21]）和Pou域（TGCAA / T [22，23]），并且已经证明指定果蝇OR的子集[21、24、25]。 Fer1是一种基本的螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH），并结合称为Ebox基序（CAGCTG）的核心序列的变异。生物信息学分析表明，三个TF的结合基序存在于直接位于启动子区域上游的簇中，见图1（A）。我们以前的遗传实验表明，动机簇起微型增强子的作用，足以驱动Or59b OSN类的表达。尽管簇中的所有四个动机都是短暂的而不是共识，但实验证明它们是必需的，并且短暂的TF结合足以诱导表达。广泛的突变分析提出了一个模型，其中两个Pou-Homeobox蛋白Acj6和Pdm3打开染色质，基本的螺旋-环-螺旋蛋白Fer1诱导表达。开放因子和Fer1之间的竞争限制了表达。增强子和附近的Fer1之间的局部协作相互作用稳定了表达。遗传研究表明，TF与染色质之间的相互作用很复杂。当甲基转移酶使组蛋白三甲基化时，染色质会暂时打开，这很可能是通过甲基转移酶与Acj6或Pdm3形成的复合物完成的。
在这里，我们表明统计热力学理论为数学模型提供了一个合适的框架，该数学模型的范围比以前提出的定性模型更广，并且可以定量地描述Or59b簇驱动的表达调控。
即使在显微镜下，非常快速的动力学事件链导致Fer1结合（TF结合Homeobox和Pou结构域，暂时打开染色质，分离并让Fer1结合Ebox），在我们的模型中，Acj6或Pdm3与Fer1的因果相互作用是以静态方式描述，如通常在平衡模型中所做的那样。出于相同的原因，并且为了使模型保持可处理的大小，与绑定/解绑定事件相关的临时染色质重塑没有明确描述。
建立了数学框架，整合了我们对Or59b基因调控的体内实验证据。先前证明的调节相互作用可以在48个不同的配置状态下排列，表示为σk，k = 1......48，显示在图A-Bof S1 文本中。与这些状态中的每一个相关联的是非归一化概率，其总和给出了系统的总分区函数。反过来，这可用于计算RNAp结合的概率，以下记为P or59b binding，有关结合细节，请参见方法和S1文本。在我们的平衡模型中，可以通过系统的可观察结合来鉴定P or59b binding，即通过Or59b簇驱动的基因表达，通过融合到TATA盒的GFP进行测量。
作为应用我们的热力学模型的一个例子，我们在论文中表明，它可以正确预测在由su（var）3纯合（即无效）突变引起的染色质状态改变的情况下Or59b簇的调控。 -9是三甲基甲酰胺H3K9的酶。该模型基于在正常染色质条件下和在su（var）3-9中存在杂合（即单等位基因）突变的实验中进行拟合。我们认为，如果杂合的su（var）3-9突变体具有使TF更易于访问DNA的作用（由于减少了H3K9的甲基化作用），那么纯合的su（var）3-9突变体应该使该过程更容易已标记。实际上，模型的这种预测在我们的新实验中得到了验证。我们得到的主要建议是，染色质的改变也可能对果蝇中OR表达的调节产生重大影响。
结果
为了研究Or59b簇如何调节表达以及TFs结合如何产生稳健的类特异性OR表达，在[26]中进行了一系列涉及突变物种和位点，改变的TF浓度和染色质三甲基化的实验，有关摘要，请参见表1和S1文本的A.
对于Or59b簇，请参见图1（A），可以对4个绑定基序中的每一个进行突变或保持不变，从而生成24个可能性，表示为真值表的行在表1和S1文本的A中。在这些表中，簇中的突变基序取值为0，而1表示非突变基序。此外，染色质可以处于正常状态（“关闭”，表1中的C列和S1文本的A），也可以处于由杂合子突变体su（var）3-9（“开放”，表1中的H栏和S1文本的A）或纯合突变体su（var）3-9（“更开放”，表1中的N栏和S1文本的A）。系统的经验可观察到的是如S1文本的表A和图1（B）所示，在收集到的各种突变体组合的整个脑部染色中表达GFP的OSN。仅考虑投射在DM4小球上的OSN的表达。整篇论文都忽略了异位表达。在表1中，通过相对于此类计数的最大值（即150 OSN）标准化GFP表达OSN的计数，将该实验证据量化为0（完全丢失）和1（非常强的表达）之间的值。归一化后，对于突变体的每种组合（以及每种染色质状态），我们获得一个间隔[l, u]，如表1所示。
将4个结合基序的二进制值与3个染色质状态相结合，我们得到16×3 = 48个可能的不同实验（不要与48个配置状态σk混淆）。对于那些有实验证据的组合，表1给出了最终的表达方式。
正常染色质状态（C列）的实验结果
让我们简要概述正常染色质状态（表1中的C列）的实验结果[26]。由完整的Or59b簇（表1中的行E16和S1文本的A）驱动的GFP表达与野生型果蝇的表达类似。 Ebox基序的突变（第E15行）导致表达完全丧失，因此表明需要bHLH蛋白来激活转录。从这个和相关的实验[26]，我们可以推断出表1中所有奇数行（以灰色显示）对应于总损耗。 Pou基序（E14）的突变导致表达几乎丧失，而Acj6Hox的突变导致的表达略高于完整的Or59b簇中的表达（即EC8中的表达略高于EC16中的表达，请参见表1），以及Pdm3Hox的突变，其表达非常强（即EC12中的表达比EC16中的表达强得多）。
突变的基序导致结合强度低得多，这意味着很少有TF可以结合它们。降低TF的浓度可以获得类似的效果（降低结合的可能性），请参见等式（1）。为了编译我们的真值表，对具有低TF表达的实验和具有结合位点突变的实验进行了等效处理（Or59b簇包含每个位点的单个副本这一事实使得这种关联成为可能）。特别是，我们考虑了一个实验，将Acj6（Acj66雄性）的敲除与Pdm3Hox突变结合起来作为双重Homeobox突变的代理（Acj6Hox + Pdm3Hox，表1中的E4行）；对Acj66雄性和突变的Pou作双突变Acj6Hox + Pou（第E6行）的实验；以及将Pdm3（Pdm3-IR）和Pou突变击倒为双突变Pdm3Hox + Pou（第E10行）的实验，有关这些实验的详细信息，请参见[26]和S1 Text。
su（var）3-9杂合子突变体（H列）的实验结果
su（var）3-9的杂合突变与特异性结合位点的突变相结合，产生了关于正常染色质状态的一组不同的表达模式，见表1 H栏和图1（B）。特别地，在杂合突变体su（var）3-9背景中，突变Acj6Hox模体（E8）的结果是减弱了相对于正常染色质状态的表达，而没有导致Pdm3Hox突变（E12）在任何明显的差异，表明表观遗传状态以不同的方式影响这两个TF的作用。此外，当只有Pou突变时（E14），弱挽救的表达代替了几乎完全的丢失。在这种情况下，Ebox的突变没有引起差异，导致表达完全丧失。没有可用于间接实验的信息（行E4，E6，E10）。进一步注意（请参阅S1文本的表A），在完整簇情况下（行E16），su（var）3-9的不同重复序列如何产生不同的结果，从而增加了系统的不确定性（和我们的模型）。
C和H列的模型拟合
C和H列用于将数值拟合到我们模型的参数。该模型的详细信息在方法部分和S1文本中进行了描述。结合能qj，合作与竞争相互作用系数wjn和表观遗传因子hm是模型的调整变量。为了进行参数拟合，已强加了具有生物学意义和一致性约束的适当值范围（在表2、3和4中列出）。然后按照方法中所述在结果参数空间中进行随机搜索。在我们的模型中重现这两列所有实验的表达间隔已经是一项艰巨的任务。特别是，似乎不可能用相同的表观遗传参数同时拟合两列C和H，这意味着必须将染色质状态引起的变化明确纳入模型中。因此，我们假设表观遗传参数hm可以从正常染色质状态变为杂合su（var）3-9突变体，而描述结合强度qj和分子相互作用wjn的参数在所有表观遗传条件下均保持不变。参数的拟合值在S1文本的图C和表4中报告。
为了描述从C传递到H时表达的变化，所有五个表观遗传参数hm都必须变化，请参见表4和S1文本的图D。即使尽我们所能调整hm，也只有一小部分（已过滤，请参见方法）的样本（约0.5％）满足对模型的13个参数qj和wjn施加的所有约束，并且同时满足所有实验表达间隔（表1所列）。有关模型预测的Or59b表达值的分布，请参见图2（A）和2（B）RNAp结合P Or59b 的概率分布，请参见方法）在 16 行C列和H列表格。
