2021-09-19二代测序技术-1

第二代测序技术又称为下一代测序（NGS），与第一代相比主要是1.高通量测序2.边合成边测序。
回顾二代测序的发展史
1996年Ronaghi和Uhlen发明了焦磷酸测序，454 Life sciences 公司基于此原理推出了测序系统Genome Sequencer 20System，标志着二代测序的商用；
2006和07年 Solexa和ABI公司推出了GA SOLID测序平台
2010年Life Technologies 推出Ion PGM系统
2014年华大推出了BGISEQ-1000

1.Illumina/Solexa测序平台
之前也总结过Illumina测序的原理，现简要梗概一下其步骤
1）DNA文库准备：先将DNA链打断成200-500bp的片段，末端修复后在两端连上特异性的接头
2）流动槽杂交：
带有接头的DNA片段流过流通池，与其上固定的种接头通过互补配对结合。这些固定的接头其后充当引物的作用，在聚合酶的作用下进行合成反应。
3）DNA合成后，变性使得未与流动池共价连接的DNA链解离并洗掉，反向练则以共价键结合在流动池的表面。因为DNA单链另一端也含有接头，能够和临近的接头互补，DNA链形成桥式结构，同样的这个相邻的接头充当引物，在DNA聚合酶的作用下，合成双链桥式结构。重复此过程，形成5000-10000个copy。这个目的是形成序列相同的DNA簇，使得在测序的过程中产生足够强的信号。变性打开，各自形成单链的DNA链固定在表面。将反向链切除，将正向链的的3‘封闭，以免产生不必要的DNA延伸。

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4）DNA测序：加入测序引物，DNA聚合酶，4种带不同荧光标记的dNTP，且这些dNTPde3’端羟基被封闭，无法继续下一个反应。计算机检测到荧光的信号后，将不同的信号转化为对应的碱基。加入化学试剂淬灭信号，并去除3’的保护基团，并进行下一个碱基的反应。
illumina测序一般能够检测150个碱基左右，因为在后续，由于DNA合成酶活力下降等原因，造成相同序列的DNA信号不一致，DNA测序的准确性下降。
在实际的测序过程中，通常一次性会测不同物种来源的DNA，此时，需要barcode来进行标记。不同的物种带有不同的barcode序列，在DNA测序完成后，需要加入barcode引物，将barcode也进行测序。

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以上面这张图为例，接头也就是固定在流通池表面的序列，一般称为adapter，位于最两端。随后是SP1/SP2，是在DNA测序的时候加入的引物匹配的位置，如果是双端测序，那么就有两个引物的结合位点。其后就是barcode，barcode引物就是结合在此处。
illumina的测序仪包括:
低通量的MiSeq，MiniSeq，ISeq
高通量的Seq系列， HiSeq系列，NextSeq系列
目前采用最广泛的是HiSeq和NovaSeq
HiSeqXTen是针对人群全基因组测序，通量能达到1000000Mb
2.Thermo Fisher/Life Technologies/Ion Torrent 测序系统

该测序系统基半导体测序原理，不需要进行光学感应。
原理简要概括如下：
在测序的过程中，识别不同的碱基不是依靠荧光信号，而是通过dNTP结合释放的H+。

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首先在建库的过程中，其与illumina的不同在于，Ion Torrent所加的接头是平末端，而illumian是3’末端突出。
考虑到每个接头都占据了一定的碱基，在测序的时候这些已知的序列占据了一部分的读长，所以，这些引物加上了特殊的化学修饰，能够被切除，这就增加了目的序列测序的长度。

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Ion Torrent的测序是在一个个油包水的小液滴中进行的。先将文库、带有5’生物素标记的引物、酶、Master Mix、测序珠子先在水相中混合好，测序柱子表面共价连接了和接头互补的序列。混合好之后再加入油，形成相互独立的文库。
通过链霉亲和素反应将发生了PCR反应的珠子纯化出来，进行后续的测序。
在测序时，分别使得ATCG四种溶液依次流过反应槽，当发生反应时，pH下降，那么就代表相应的碱基配对。
这个方法的优点在于价格低很多，因为不需要激光、成像等设备，所需要的DNA量很少，5-10ng级别的即可。

更多的信息详见7种测序平台 - Thinkando - 博客园 (cnblogs.com)
补充：
罗氏454测序
罗氏454的焦磷酸测序是最早发行的二代测序。其测序的文库的建立和Ion Torrent相似，一个磁珠吸附一个模板DNA，充当一个微型的反应器。外面裹以油，将不同的液滴隔离开来。不同的片段平行扩增，待反应结束后，破坏乳液，只剩下磁珠。此时一个磁珠=一条读长。
将磁珠放在PTP板中测序，依次加入ATCG四种碱基。让碱基能够成功配对时，会释放一个焦磷酸。

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如图焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。