操作步骤
(1)取2 mL离心管放组织,加入500 μL Hombuffer,进行组织匀浆。
(2)加入20 μL (20mg/ml)的蛋白酶K,在55℃消解至少3 h(5 h),每隔1 h摇动一次。
(3)加入500 μL NaCl(4.5M),300 μL氯仿,混合20 min,离心(13000 rpm,10 min)。
(4)将上清液500 μL转入1.5ml离心管中,加入500 μL无水异丙醇,混合20 min,离心(13000 rpm,10min),倒掉上清。
(5)加500 μ 75%乙醇,55 ℃消化5 min,离心(13000 rpm,5 min),倒掉上清。
(6)将离心管室温下倒立于吸水纸上自然干燥(放入通风厨通风干燥)。
(7)向离心管中加入50 μL ddH2O(提前预热至65℃),溶解DNA.
(8)取2 μL DNA溶液,用Nandrop检测DNA溶液的浓度。
(9)取8 μL DNA溶液,跑胶检测质量。
(10)检测完毕后,于-20 ℃保存备用。
原理
氯仿:使蛋白质变性,有助于水和有机质分离。
异丙醇:减少蛋白质变性操作过程中产生泡沫,有助于分相。
4.5M氯化钠:增加DNA溶解度而与其他杂质分离【DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变,溶解度在质量浓度为2mol/L时最大、在质量浓度为0.14mol/L时最小】。
离心后:上层是含DNA的水相。中层是变性的蛋白相。下层是有机溶剂。
溶液配方
HomBuffer---1L体积
EDTA-Na2H2O 80mmol/L × 372.24 = 29.78g
Tris 100mmol/L × 121.14 = 12.114g
SDS 0.5% 5g
蛋白酶K(20mg/mL)
100mg Proteinase K
4.5 mL ddH2O
6 μL 2.5M CaCl2
500 μL pH8.0 1M Tris-HCl
