Encoding Sanger / Illumina 1.9 [测序平台的版本和相应的编码版本号]
Total Sequences [total reads的数量]
Sequence length [测序长度]
%GC [GC含量]

1、Per base sequence content：序列碱基含量

四种不同碱基占总碱基数的比例，检测有无AT、GC分离的现象。
正常情况下四种碱基出现的频率应是接近的，且没有位置差异.
因此，好的样品中四条线应该是平行且接近的，
注：由于刚开始测序仪状态不稳定，可能造成前几个bp有波动。

• 在 reads 开头出现碱基组成偏离---可能是建库操作造成的（建 GBS 文库时在 reads 开头加了 barcode；barcode 的碱基组成不是均一的，酶切位点的碱基组成是固定不变的，这样会造成明显的碱基组成偏离）
• 在 reads 结尾出现的碱基组成偏离---可能是测序接头的污染造成的。
• 当所有位置的碱基比例一致现出偏差时，即四条线平行且分开，代表文库有偏差，或测序中的系统误差；
• 当部分位置碱基的比例出现偏差时，即四条线在某些位置【纷乱交织】，则有overrepresented sequence的污染。

当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报"WARN"；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报"FAIL"

问题较大的：

WT34_FKDL202606074-1a_2.fq.gz   是 2？

WT34

图中可以看出：

• 前1-10bp左右出现碱基组成偏离==》
• 在中间 75bp开始出现了GC分离==》
  当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报"FAIL"
  结合后续 Overrepresented sequences 参数报告（下图），说明有overrepresented sequence的污染
  
  Overrepresented sequences
  需要使用参数来查找线索：

-c              Specifies a non-default file which contains the list of
--contaminants  contaminants to screen overrepresented sequences against.
                The file must contain sets of named contaminants in the
                form name[tab]sequence.  Lines prefixed with a hash will
                be ignored.

....失败，没有找到这个contaminants.list 文件。

其他可能有问题的：（都是read2）

KR6-2

KR8-2

KR8-2

Q1-2

Q3-2

WT36-2

worn！均有不同程度的overrepresented sequence的污染

2、Per sequence GC content 平均GC含量

蓝线是理论分布（正态分布，通过从所测数据计算并构建分布图）
红色是实际情况，两个比较接近判为好的。

• 曲线形状的偏差可能是由于文库的污染 或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）；
• 形状接近正态分布但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差；
• 如果出现两个或多个峰值，表明测序数据里可能有其他来源的DNA序列污染，或者有接头序列的二聚体污染。
• 偏离理论分布的reads超过15%时，报"WARN"；偏离理论分布的reads超过30%时，报"FAIL"
  两个应该比较接近才比较好

问题较大的：

Q1-1

由图中看出：
红色线出现双峰
报"FAIL"，说明 偏离理论分布的reads超过30%

Q1-2

# 出现双峰;报"FAIL"，说明 偏离理论分布的reads超过30%

Q3-1

WT36

WT36：出现双峰;报"FAIL"，说明 偏离理论分布的reads超过30%

3 adapter content：

• 若有adapter残留，后续必须去接头（在后续分析的时候需要先使用cutadapt软件进行去接头，也可以用 trimmomatic来去除接头）

• 横轴表示碱基位置，纵轴表示百分比。

  
  
  KR6
  
  

  需要去除：总read 150 bp

补充知识点：

adapter是一段短的序列已知的核酸链，用于链接序列未知的目标测序片段。
barcode，也称为index，是一段很短的寡居核酸链，用于在多个样品混合测序时，标记不同的样品。
insert是用于测序的目标片段，因为是包括在两个adapter之间，所以被称为“插入”片段。

一个常见测序片段类似与adapter--barcode--insert--adapter。
测序开始时前几个碱基无法测得，第一个adapter在数据输出时被去除；
由于测序仪读长限制，第二个adapter通常无法测得。
所以，经常得到类似 barcode--部分insert的read。

• 把barcode去除，只保留测度insert的片段 ,即demultiplexing。
• 但有时候测序时会得到barcode--insert的read--部分adapter，那么这里就包含接头（部分adapter），即要去除的部分。
  参考：

第一步：找到接头：
（1）如何知道接头序列！(测序公式给或者自己按照测序信息在github可以查到或者Download common Illumina adapters from)
less *.fq.gz

查看

@A00821:483:HKH7FDSXY:1:1101:26259:1000 2:N:0:TCATCTCC

cutadapt 几个参数：
-a：左端reads的接头
-A：右端reads的接头，注意右端出现的接头是因为侧穿，所以他的接头序列是左端reads的接头的反向互补序列
-m：表示去除接头后如果read长度小于这个m值就不要
--pair-filter：采用双末端模式来去除接头，保持两端数据匹配

cutadapt -a adapt2 -A adapt1_REV -m 20 --pair-filter=both -o out_fq1 -p out_fq2 fq1 fq2

安装cutadapt：
pip install cutadapt

细节参考：http://www.bio-info-trainee.com/1920.html