一、安装及载入
1.直接安装
install.packages("Seurat")
- BiocManager 安装
# 建议下载安装时更换成国内镜像，例如：
options(repos="http://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/")
options(BioC_mirror="http://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/bioconductor/")
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager") #安装管理工具包BiocManager
BiocManager::install() #查看是否安装成功
BiocManager::install("Seurat")
- devtools 安装
install.packages('remotes')
remotes::install_github(repo = 'satijalab/seurat', ref = 'develop')
library(Seurat)
- conda 安装
如果上述步骤尝试不可行，请尝试下面方法用 conda 安装 R 及 Seurat
#创建r4的虚拟环境
conda install r-base=4.2.3 -c conda-forge
conda install r-seurat （安装的版本为4.2.3）
用conda 安装的R包将储存在~/miniconda3/envs/r4/lib/R/library
加载报错，解决办法
参考：https://www.jianshu.com/p/d90da82c4b54
https://blog.csdn.net/weixin_44833976/article/details/123295048
> library(Seurat)
Error: package or namespace load failed for ‘Seurat’ in dyn.load(file, DLLpath = DLLpath, ...):
unable to load shared object '/Anaconda3/2022.05/envs/sc/lib/R/library/stringi/libs/stringi.so':
libicui18n.so.58: cannot open shared object file: No such file or directory
In addition: Warning message:
package ‘Seurat’ was built under R version 4.2.2
二、数据导入
自己的数据 cellranger 之后在outs文件夹中是三个标准文件barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz，但挖掘公共单细胞数据集时，会遇到常见各种单细胞测序数据格式。
（1）标准10Xgenomics类型:barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz
（2）表达矩阵
（3）h5
（4）h5ad
格式一：barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz
这是cellranger上游比对分析产生的3个文件，分别代表细胞标签(barcode)、基因ID(feature)、表达数据（matrix）
一般先使用read10X()对这三个文件进行整合，得到行为基因、列为细胞的表达矩阵（为稀疏矩阵dgCMatrix格式，节约内存，是未标准化的数据，如原始计数或TPMs）；之后再配合CreateSeuratObject()函数创建Seurat对象
创建代码如下
library(Seurat)
dir="./data/HCC2/filtered_feature_bc_matrix/"
list.files(dir)
[1] "barcodes.tsv.gz" "features.tsv.gz" "matrix.mtx.gz"
# 1. 读取数据
counts <- Read10X(data.dir = dir)
class(counts)
[1] "dgCMatrix"
attr(,"package")
[1] "Matrix"
## # 2.获得 Seurat 对象
scRNA <- CreateSeuratObject(counts = counts)
scRNA
#An object of class Seurat
#33694 features across 9112 samples within 1 assay
#Active assay: RNA (33694 features, 0 variable features)
如上Read10X()函数接受的参数为目录名，该目录包含了所需的三个配套文件；
值得注意的是三个文件名只能分别是barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz，然后read10X函数可以自动加载。如上截图那样就是需要修改的~
关于barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz三个文件的格式与内容
- 一般来说直接使用
read10X()不会出现什么问题，但有一些数据集，比如GSE148192容易出现报错。
dir = "./GSE148192_RAW/GSM4462451/"
list.files(dir)
#[1] "barcodes.tsv.gz" "features.tsv.gz" "matrix.mtx.gz"
counts = Read10X(dir)
#Error in dimnamesGets(x, value) :
# invalid dimnames given for “dgTMatrix” object
- 所以这个GSE ID提供的数据格式可能是有点问题，接下来就通过对比GSE166635的GSM5076750(可以正常读入)与GSE148192的GSM4462451(读入失败)，探索下这三个文件的格式
（1）barcodes.tsv
如下看出就简单的一列，为细胞的barcode标签信息
AAACATACAACCAC-1
AAACATTGAGCTAC-1
AAACATTGATCAGC-1
AAACCGTGCTTCCG-1
（2）features.tsv
如下可以看出均为基因的注释信息，前两列为基因ID 和 symbol
ENSG00000243485 MIR1302-10
ENSG00000237613 FAM138A
ENSG00000186092 OR4F5
ENSG00000238009 RP11-34P13.7
（3）matrix.mtx
前三行为注释信息，其中第三行为total number genes、cells、counts)
结合上述细胞标签与基因名信息，知道了前两列分别为基因和细胞的索引，第三列为表达信息。
%%MatrixMarket matrix coordinate real general
%
32738 2700 2286884
32709 1 4
32707 1 1
32706 1 10
32704 1 1
matrix.mtx 是 MatrixMarket格式文件：
- 文件中储存非零值;
- 注释使用%标记；
- 第一行包含文件中总行数，总列数，总的记录数
- 每行中提供记录的所处的行号和列号，已经记录的内容
更多内容见：http://math.nist.gov/MatrixMarket/formats.html
格式二：直接提供表达矩阵
这种是最方便的，直接创建Seurat即可
scRNA <- CreateSeuratObject(counts = counts)
scRNA
格式三：h5格式文件
- 使用
Read10X_h5()函数，读入表达矩阵，在创建Seurat对象 - 示例数据：GSE138433
sce <- Read10X_h5(filename = GSM4107899_LH16.3814_raw_gene_bc_matrices_h5.h5")
sce <- CreateSeuratObject(counts = sce)
格式四：h5ad格式
- 需要安装，使用
SeuratDisk包的两个函数； - 先将后
h5ad格式转换为h5seurat格式，再使用LoadH5Seurat()函数读取Seurat对象。 - 示例数据集：GSE153643
#remotes::install_github("mojaveazure/seurat-disk")
library(SeuratDisk)
Convert("GSE153643_RAW/GSM4648565_liver_raw_counts.h5ad", "h5seurat",
overwrite = TRUE,assay = "RNA")
scRNA <- LoadH5Seurat("GSE153643_RAW/GSM4648565_liver_raw_counts.h5seurat")
不管是哪种格式，最后都要获得的是一个稀疏矩阵：行为基因名，列为barcode
至于barcode到底是注释到什么细胞类型，这个一般公共数据是不会有的，barcode只能帮助我们对不同的细胞进行区分
