大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。
近日，《Experimental Hematology & Oncology》期刊发表了题为“NAT10-mediated lipid metabolic reprogramming drives EGFR-TKI resistance in non-small cell lung cancer via ac4C-dependent mRNA stabilization”的研究论文。研究聚焦非小细胞肺癌（NSCLC）中表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）耐药这一重大临床难题，系统揭示了N-乙酰转移酶10（NAT10）通过催化RNA的N4-乙酰胞苷（ac4C）修饰，稳定脂肪酸转运蛋白4（FATP4）和肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）mRNA，从而重编程脂质代谢、驱动EGFR-TKI耐药的全新分子机制。
研究还发现p300介导的H3K27ac组蛋白乙酰化是NAT10转录激活的上游关键调控因子，并证实NAT10抑制剂Remodelin与EGFR-TKI联用干预可显著增强抗肿瘤效果。该研究构建了“p300-H3K27ac-NAT10-ac4C-FATP4/CPT1A-脂质代谢-EGFR-TKI耐药”的全新调控轴，为克服NSCLC靶向治疗耐药提供了新的潜在靶点和联合治疗策略。
英文标题：NAT10-mediated lipid metabolic reprogramming drives EGFR-TKI resistance in non-small cell lung cancer via ac4C-dependent mRNA stabilization
译文标题：NAT10介导的脂质代谢重编程通过ac4C依赖性mRNA稳定，驱动非小细胞肺癌中EGFR-TKI耐药
发表时间：2025年11月27日
发表期刊：Exp Hematol Oncol
影响因子：IF13.5/Q1
技术平台：acRIP-seq、RNA-seq
作者单位：宁波大学附属第一医院、厦门大学第一附属医院、复旦大学中山医院
DOI：10.1186/S40164-025-00721-9
易小结
本研究将RNA ac4C修饰与靶向治疗耐药及代谢重编程三大领域整合，确立了ac4C修饰作为连接基因表达调控与代谢重编程的关键分子桥梁，为开发“表观遗传-代谢”双靶点联合干预策略奠定理论基础，具有重要的转化医学价值。
本研究acRIP-seq不仅绘制了NAT10依赖的ac4C修饰图谱，更通过与RNA-seq联合分析鉴定出FATP4和CPT1A等关键代谢酶mRNA上的功能性修饰位点，为后续机制验证提供精确分子坐标。未来acRIP-seq技术应用可进一步拓展至其他癌症类型及耐药模型，系统解析ac4C修饰介导的基因调控网络。
研究方法
（1）药物筛选与模型构建
使用168种表观遗传因子抑制剂库联合吉非替尼进行高通量筛选，鉴定出增敏剂Remodelin；构建EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞系（H1975、H1650）及患者来源类器官（PDO）模型。
（2）临床样本与分析
收集138对NSCLC及癌旁组织，通过qRT-PCR、免疫组化分析NAT10表达；利用TCGA、GEO公共数据库验证NAT10表达与患者预后关联。
（3）基因表达调控分析
采用shRNA敲低或过表达质粒，在细胞中调控NAT10、FATP4、CPT1A、p300等基因表达，并通过CCK-8、克隆形成、流式细胞术（凋亡检测）评估其对增殖、凋亡及EGFR-TKI敏感性的影响。
（4）动物模型
构建裸鼠皮下移植瘤模型，体内验证NAT10敲低或Remodelin联合吉非替尼的治疗效果。
（5）代谢组学与功能分析
LC-MS/MS非靶向代谢组学分析，检测细胞氧消耗率（OCR）、脂滴积累等。
（6）分子机制探索
RNA-seq测序：分析NAT10敲低后的差异表达基因及KEGG、GSEA通路富集。
染色质免疫沉淀（ChIP）：验证p300结合及H3K27ac修饰在NAT10启动子区的富集。
乙酰化RNA免疫沉淀测序（acRIP-seq）：在全转录组范围内鉴定NAT10依赖的ac4C修饰位点及靶基因。
（7）功能验证实验
acRIP-qPCR：验证特定靶标（FATP4、CPT1A）mRNA上的ac4C修饰及其对mRNA稳定性和翻译效率的影响。
报告基因实验：评估mRNA半衰期、构建野生型与ac4C位点突变型荧光素酶报告基因验证修饰功能。
Western Blot：检测目标蛋白表达变化。
结果图形
（1）从表观遗传药物库中筛选并验证Remodelin可增强NSCLC对EGFR-TKI治疗的敏感性
研究首先通过对EGFR-TKI天然耐药的NSCLC细胞系（H1975， H1650）进行表观遗传药物库（168种抑制剂）与吉非替尼的联合筛选，研究者鉴定出包括Remodelin在内的四种化合物能显著增敏耐药细胞对吉非替尼的反应（图1B）。在患者来源的NSCLC类器官模型中进行验证，同样证实Remodelin能有效恢复类器官对吉非替尼和奥希替尼的敏感性，抑制其肿瘤进展（图1C-F）。进一步克隆形成实验和流式细胞分析表明，Remodelin与EGFR-TKI联用能协同抑制HCC2279、PC-9/GR耐药细胞的增殖并诱导其凋亡（图1G-H）。
（2）NAT10上调与NSCLC恶性表征及不良预后密切相关
既往研究报道Remodelin作为NAT10抑制剂可增强癌细胞对治疗的敏感性，研究靶向NAT10。研究团队检测了耐药与敏感细胞系及患者组织中NAT10的表达水平。结果显示，耐药NSCLC细胞系中NAT10 mRNA和蛋白水平均显著高于敏感细胞系，提示NAT10表达与耐药发生相关。进一步对138对NSCLC及癌旁正常组织样本进行qRT-PCR分析，发现肿瘤组织中NAT10的mRNA和蛋白水平均显著高于癌旁组织（图2A、E）。TCGA和GEO数据库分析也一致支持NAT10在NSCLC中高表达（图2B-D）。生存分析表明，高表达NAT10的患者总生存期（OS）和无病生存期（DFS）更短，是多变量Cox回归分析中NSCLC不良临床结局的独立预测因子（图2F-G）。此外，对吉非替尼或奥希替尼获得性耐药患者的组织样本显示，其NAT10表达水平显著高于药物敏感患者（图2H）。综上所述，NAT10表达与NSCLC耐药发生及不良临床结局（包括晚期肿瘤分期和预后不良）显著相关。
（3）NAT10敲低可抑制细胞增殖并增强EGFR-TKI治疗敏感性
为探究NAT10对NSCLC细胞EGFR-TKI耐药的作用，研究团队在两种耐药细胞系H1650和H1975中靶向敲低NAT10。CCK-8实验和克隆形成实验证明，NAT10敲低联合EGFR-TKI处理，能更强抑制细胞活力和长期增殖能力（图3A-B）。流式细胞术和Western blot评估NAT10敲低后H1975和H1650细胞在奥希替尼或吉非替尼处理下的凋亡率（图3C），结果表明NAT10敲低显著提高NSCLC细胞对吉非替尼和奥希替尼的敏感性。为评估体内效应，建立皮下移植瘤模型，注射对照或shNAT10处理的NSCLC细胞，待肿瘤生长后口服给予吉非替尼或奥希替尼治疗并定期监测。结果显示吉非替尼和奥希替尼显著抑制肿瘤生长（图3D-F）。肿瘤组织H&E染色和Ki-67免疫组化分析表明，NAT10敲低显著增强吉非替尼和奥希替尼的治疗效果（图3G），表现为肿瘤体积和重量减小，Ki-67阳性增殖细胞减少。上述发现表明NAT10是EGFR-TKI耐药的主要驱动因子，靶向NAT10可增强NSCLC中EGFR-TKI治疗效果。
（4）NAT10调控NSCLC中的脂质代谢重编程
为阐明NAT10在NSCLC发病和进展中的作用，研究团队对NAT10敲低的NSCLC细胞进行转录组测序（RNA-seq），发现差异下调基因显著富集于脂质代谢相关通路（图4A-D）。qRT-PCR验证NAT10过表达介导脂质代谢基因上调（图4E）。
具体而言，NAT10敲低显著降低H1650和H1975细胞的耗氧率（OCR）、基础呼吸、ATP生成、最大呼吸和备用呼吸能力，提示线粒体功能和整体细胞代谢受损（图4F-G）。此外，H1650细胞的代谢组学分析显示多种代谢产物水平改变，进一步证实NAT10在调控代谢过程中的功能（图4H-I）。上述研究结果表明NAT10是维持NSCLC细胞脂质代谢和能量稳态的核心调控因子。
（5）NAT10通过ac4C修饰调控FATP4和CPT1A mRNA稳定性
为探究NAT10是否通过ac4C修饰调控下游基因，研究者对对照和NAT10敲低的H1975细胞进行了acRIP-seq分析（图5A）,成功绘制NAT10依赖的ac4C修饰图谱。通过与RNA-seq数据交叉比对，并结合脂代谢通路富集信息，锁定了两个关键靶基因：负责脂肪酸摄取的FATP4和负责脂肪酸β-氧化的限速酶CPT1A（图5C）。NAT10过表达后脂肪酸氧化（FAO）和脂质摄取相关基因显著上调（图5D）。IGV可视化显示，在FATP4 mRNA的CDS区和CPT1A mRNA的3'UTR区存在明显的ac4C修饰峰，且该修饰在NAT10敲低后显著减弱（图5H）。acRIP-qPCR直接证实这两个转录本上ac4C修饰的富集依赖于NAT10（图5I）。放线菌素D追踪实验表明，NAT10敲低会加速FATP4和CPT1A mRNA的降解（图5J）。双荧光素酶报告基因实验显示，NAT10过表达仅能增强野生型（含ac4C位点）报告基因的活性。
此外，过表达催化失活的NAT10 G641E突变体未能稳定FATP4和CPT1A mRNA或增强ac4C富集（图5K-L），证明ac4C修饰在这些转录本稳定性中的关键作用。综合而言，这些发现明确表明NAT10通过ac4C修饰提高FATP4和CPT1A mRNA的稳定性，增加编码蛋白的翻译和表达，从而增强脂质代谢。
（6）NAT10通过调控FATP4和CPT1A促进NSCLC细胞的EGFR-TKI耐药
研究团队进一步分析NAT10如何通过调控关键代谢酶FATP4和CPT1A促进NSCLC细胞的EGFR-TKI耐药。在H1650细胞中敲低FATP4和CPT1A，qRT-PCR和Western blot确认其表达降低（图6A-B）。随后CCK-8、克隆形成实验和流式细胞术显示，FATP4或CPT1A敲低显著增强NSCLC细胞对奥希替尼和吉非替尼的敏感性（图6C-E）。功能挽救实验进一步验证NAT10的调控作用：在NAT10敲低细胞中过表达FATP4或CPT1A可逆转TKI增敏；而在TKI敏感的PC9细胞中过表达NAT10增加其对TKI药物耐药性，但该效应可被FATP4或CPT1A敲低抑制，表明NAT10至少部分通过这些酶促进TKI耐药（图6F）。
体内皮下移植瘤模型研究显示，NAT10敲低细胞并过表达FATP4或CPT1A的肿瘤生长速度显著快于仅NAT10敲低肿瘤（图6G-I）。H&E染色和免疫组化分析进一步证实FATP4和CPT1A在体内促进肿瘤生长，与分子生物学结果一致（图6J）。这些结果表明NAT10通过调控FATP4和CPT1A增强NSCLC细胞EGFR-TKI耐药。
（7）p300介导的H3K27ac激活NSCLC中的NAT10转录
研究进一步分析NAT10在肿瘤中高表达的上游机制。生物信息学分析和ChIP实验表明，组蛋白乙酰转移酶p300催化产生的H3K27ac修饰，在NAT10启动子区高度富集（图7A、H-I）。使用p300抑制剂C646或shRNA敲低p300，均能剂量和时序依赖性降低H3K27ac水平和NAT10的mRNA及蛋白表达（图7B-G）。
值得注意的是，p300敲低显著降低了NAT10启动子内H3K27ac的富集（图7H-I），表明p300介导的H3K27ac在激活NAT10转录中发挥关键作用。上述研究结果提示p300介导的H3K27ac是NSCLC中NAT10转录的关键驱动因子（图7J）。
（8）Remodelin在体外和体内均能增强NSCLC对吉非替尼的敏感性
基于上述机制，研究者评估了靶向NAT10的治疗潜力。体外实验表明，Remodelin与吉非替尼联用，表现出协同的抗增殖效果（图8A-C）。该组合联用还能更有效抑制细胞的脂质摄取和线粒体呼吸功能。在动物模型中，Remodelin联合吉非替尼治疗，比单药治疗更能显著抑制肿瘤生长（图8D-F）。肿瘤组织的H&E染色和免疫组化分析显示联合治疗组增殖减少，进一步支持Remodelin联合吉非替尼的增强治疗效果（图8G-H）。
为探究该协同效应的机制并评估线粒体功能，进行了耗氧率（OCR）测定，结果提示Remodelin通过干扰线粒体和脂质代谢增强NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性（图8I）。该研究表明，Remodelin联合吉非替尼通过同时靶向脂质代谢和线粒体功能，可能为克服NSCLC的EGFR-TKI耐药提供可行性治疗策略。
结论和启示
本研究通过acRIP-seq等分析揭示NAT10是NSCLC脂质代谢重编程和EGFR-TKI耐药的主要调控因子。NAT10通过ac4C修饰增强FATP4和CPT1A mRNA的稳定性，上调其蛋白表达，从而促进脂肪酸摄取和氧化，维持肿瘤细胞能量代谢和存活，最终导致EGFR-TKI耐药。p300介导的H3K27ac组蛋白乙酰化是NAT10转录激活的关键上游机制。NAT10抑制剂Remodelin联合EGFR-TKI（吉非替尼或奥希替尼）在体内外均显著增强抗肿瘤疗效，通过协同抑制脂质代谢和线粒体功能克服EGFR-TKI耐药，为临床转化提供了实验依据。
acRIP-seq在本研究中的重要作用
（1) [endif]在NSCLC耐药模型中系统绘制NAT10依赖的ac4C修饰全转录组图谱，为后续靶点筛选提供全局视角；
（2) [endif]在FATP4 mRNA的CDS区和CPT1A mRNA的3'UTR区鉴定差异ac4C修饰峰，结合IGV可视化分析明确修饰位点的精确坐标，为后续定点突变和功能验证实验提供直接靶点；
（3) [endif]将acRIP-seq数据与RNA-seq数据进行交集分析，筛选出既受ac4C修饰调控又发生表达变化的候选基因FATP4和CPT1A，显著提高了从海量测序数据中挖掘功能性靶标的效率。
参考文献：Fang S, Zhu Y, Chen W, Mao W, Fang Y, Chen Z, Hong Z, Zhao X, Su W, Pan Y, Yao G, Wang J, Zhou C. NAT10-mediated lipid metabolic reprogramming drives EGFR-TKI resistance in non-small cell lung cancer via ac4C-dependent mRNA stabilization. Exp Hematol Oncol. 2025 Nov 27;14(1):134. doi: 10.1186/s40164-025-00721-9.
