染色质免疫沉淀ChIP实验指南之(2):技术原理&技术流程

技术原理:

染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChIP)的基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联,超声波或酶切将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后用所研究的目的蛋白质抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合体,从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,以便用于下游的PCR分析和Sequence测序。

ChIP-qPCR用于检测通过蛋白特异性免疫沉淀富集得到的特定 DNA 序列的相对数量。ChIP-sequence能对蛋白-DNA 相互作用和组蛋白修饰进行全基因组范围内的分析。

两大技术路线:

因为:甲醛交联后的染色质对限制性内切酶、MNase及DNase I高度抵抗,不易被酶切断。通常需要使用超声波来物理打断染色质。

所以:根据实验者研究的目的蛋白不同,采用2种不同的技术路线

1、如果研究的是转录因子,转录因子和启动子DNA元件的结合一般都是弱结合,是容易解离的,且转录因子在细胞内的丰度较低,所以一般采用甲醛固定交联转录因子和DNA,超声打断得到染色质小片段的技术流程。

2、如果研究的是组蛋白甲基化或乙酰化修饰,细胞内丰度较高,且DNA缠绕在组蛋白上,是相对强结合,不易解离,因此一般无需甲醛固定交联,MNase (Micrococcal Nuclease) 酶切即可得到染色质小片段。

两类CHIP实验的差异图

上图为转录因子类ChIP(左)和组蛋白修饰类ChIP(右)的微观差异图

两种技术流程的步骤有所不同,流程图分别如下所示:

组蛋白修饰类天然ChIP实验流程



转录因子类甲醛交联ChIP实验流程


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