刚接触磁珠（beads）纯化时，觉得磁珠这东西好神奇，竟然能回收不同长度的DNA。其实磁珠只是能吸附大于某个长度的DNA，如果要筛选特定大小范围的DNA，需要做两步磁珠纯化，先用较稀的磁珠吸附走过大的片段，然后用较浓的磁珠筛选掉过小的片段，剩下就是想要的大小范围的DNA。

一、磁珠吸附DNA和片段筛选原理

       一般磁珠由三层构成，最里面是聚苯乙烯，外面包裹一层磁性物质四氧化三铁，最外面再包一层高分子材料，上面偶联不同的官能团。不同功能的磁珠，偶联的官能团不同，纯化核酸用的一般是羧基（-COOH）。

       磁珠纯化DNA/RNA核心技术是固相可逆固定化技术（Solid-phase reversible immobilization，SPRI），但磁珠和DNA具体是如果相互作用吸附在一起，目前还不是很清楚，盐桥理论是其中猜想之一。在较高浓度的PEG和NaCl溶液中，PEG夺取DNA分子外面水化层的水，导致水化层被破坏，DNA分子发生聚集沉淀，带负电的磷酸基团裸露出来，通过钠离子与磁珠表面的羧基形成“盐桥”，或者也叫“电桥”，使得DNA吸附到磁珠表面。

       DNA越长，表面裸露出来带负电的磷酸基团越多，整条分子带的负电就更强，更容易吸附到磁珠，只需要较低浓度的PEG和NaCl，就可以回收；DNA越短，就需要更高浓度的PEG和NaCl，将其表面的水化层破坏得更彻底，裸露出来足够多带负电的磷酸基团，才能被磁珠吸附住，从而回收回来。所以如果想回收较短的DNA片段时，需要加入的磁珠体积更大。

       此外，体系中的PEG还可以增加溶液的粘稠度，让磁珠保持悬浮不容易沉聚，在DNA binding过程中更充分与DNA接触，同时PEG也不易造成蛋白变性和非特异性吸附。但是PEG的DNA沉聚效果容易收到pH、温度等的影响，温度过低PEG也不易与水完全互溶，所以磁珠一般都要求室温平衡后再用，其储存buffer里也会加一些低浓度的pH稳定剂，如Tris-HCl等。

二、酒精清洗盐离子

       DNA吸附上磁珠之后，会用75—85%的酒精去清洗体系中残留的盐，盐被洗掉了，盐桥被破坏，DNA不就从磁珠上掉下来了吗？其实不是这样的，第一，DNA在这个浓度的酒精里溶解度很低；第二，DNA这个时候是聚集状态，磁珠刚好提供一个聚集的奇点，让DNA沉聚在其周围，所以绝大部分DNA不会掉下来。但酒精浓度很重要，一般都要求新鲜配制，浓度太低，体系中过多的水会将部分DNA从磁珠上溶解下来，造成DNA损失。具体使用多少浓度的酒精视情况而定，浓度越高，体系中水越少，清洗盐离子的能力减弱，但DNA的溶解度小，回收率高；酒精浓度越低，盐离子可以清洗得更干净，但DNA的回收率可能会收到影响。如果DNA片段较小（小于100bp），清洗推荐使用较高浓度的酒精，减少清洗时的损失，甚至可以在结合磁珠的时候就加入一定量的酒精，辅助DNA沉淀，以提高回收率。

三、洗脱DNA

       酒精清理后，先需要晾干磁珠上残留的酒精，以防影响下游实验。晾干后加入水或者TE buffer，这时体系中已经没有钠离子和PEG，无法形成电桥结构，带负电的DNA和磁珠之间相排斥，水重新包裹DNA形成水化层，使其从磁珠上洗脱下来，溶解到溶液中。注意晾干时磁珠表面无光泽即可，过度干燥，体系失水过多，会导致磁珠DNA进一步聚集，最终DNA很难回溶到水中，影响回收率。

四、磁珠和柱子

       柱子回收DNA原理和磁珠差不多，不同的是大多数离心柱中吸附DNA的是一层硅胶膜，实际上就是一层玻璃纤维，其表面有大量修饰的硅羟基（Si-OH），硅羟基在溶液中解离后也带负电，然后与带正电盐离子、带负电DNA形成电桥，从而吸附住DNA。目前除了少数磁珠表面也还是采用硅羟基，主流磁珠，比如Ampure XP beads，基本上都换成产量更高，非特异性结合更少的羧基化磁珠。

五、磁珠与RNA

      不管双链DNA、单链DNA，还是RNA，都可以在溶液中解离出带负电的磷酸基团，因此都可以用磁珠进行纯化回收，但单链DNA和RNA都没办法进行片段大小筛选。双链DNA的二级结果一般是一条较稳定的线性双螺旋分子，在PEG的存在下，解离出来带负电的磷酸基团多少和其长度正相关，而RNA和单链DNA，二级结构比较复杂，导致其裸露出来的负电基团无法跟长度呈正相关，所以没办法像DNA那样进行片段筛选。

       另外RNA和DNA在不同pH下稳定性不一样，所以纯化RNA的磁珠buffer中pH和纯化DNA的磁珠是不一样的。

资料参考：

John T.  Lis，Robert Schleif. Size fractionstion of double stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acid Research(1975)

L. S. Lerman. A transition to a compact form of DNA in polymer solution. PNAS(1971)

Spin column based nucleic acid purification, https://en.wikipedia.org/wiki/Spin_column-based_nucleic_acid_purification