光电倍增管电压设定
每一个流式通道都会分配有一个光电倍增管,而每一个光电倍增管的电压都是分别调控的,所以,每一个流式通道都有自己特定的光电倍增管的电压,可以分别设定。而且在流式分析时每一个使用到的流式通道都必须设定其合适的电压,才能保证流式分析时得到正确的结果。如流式检测标记有FITC、PE、PerCP和APC荧光素偶联抗体时,就必须先分别设定FSC、ssC、 FITC、PE、PerCP和APC6个通道各自的电压。
光电倍增管的电压值没有一个固定的最合适的值，影响该值设定的因素有很多。流式细胞仪的类型、仪器的结构、不同的流式通道、不同的待测目标细胞、荧光素偶联抗体的种类和流式标记方法等都会影响光电倍增管的电压设定，所以，每次实验时都必须调整各通道的电压值，而且在细胞上样分析时应实时调整，以确保流式检测得到正确的结果。
FSC和SSC通道基本上是每次流式检测都需要使用的通道，其接收的是散射光信号，与荧光素偶联抗体是否标记无关。FSC信号主要反映的是细胞的体积,所以调整该通道的电压值主要是考虑样品细胞或者目标细胞的体积大小,其设值原则是使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。如果检测的目标细胞体积较小,可以适当提高电压值,使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离;如果检测的目标细胞体积较大,可以适当降低电压值,使所有的目标细胞群完整显示于流式图中，防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外;如果有多个体积大小不同的细胞群,尽量使每个细胞群都能够显示于流式图中,并且能够相互隔开,尤其要使体积小的细胞群与细胞碎片分离。SSC信号主要反映细胞的颗粒度,所以调整该通道的电压值主要是考虑样品细胞或者目标细胞的颗粒度大小，其具体的调节原则与FSC通道相似:调节SSC电压使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置，如果目标细胞的颗粒度较小，可以适当提高电压值,如果目标细胞的颗粒度较大，可以适当降低电压值。
调节荧光通道的光电倍增管的电压通常使用未标记荧光素偶联抗体的样品细胞，流式检测时荧光通道上接收到的是样品细胞的非特异性自发荧光，设置电压的基本原则是将自发荧光控制在数轴的1/4范围内，即荧光信号在1/4内的细胞都是阴性细胞，荧光信号超过1/4的细胞都是阳性细胞.根据此原则设置电压一般都能得到较为理想的流式图，从而能够较为准确地得到流式结果.但是此原则只是一般原则，并不是每次检测都能得到理想的结果，检测时应根据具体情况适当调整电压值.如标记荧光素偶联抗体后，该通道接收到的阳性细胞荧光信号较弱，可以适当提高电压值，使弱阳性细胞与阴性细胞尽可能分离；如果阳性细胞的荧光信号过强，可以适当降低电压值，使所有的强阳性细胞都能正常显示于流式图内，以便于正确分析与统计流式结果.此外，APC-Cy7等接收长波长荧光信号的通道，自发荧光信号范围可以适当降低，因为大多数细胞的非特异性自发荧光的波长没有这么长，即达到该波长的非特异性自发荧光较弱，如果要达到1/4数轴范围可能其电压值设定会很高，此时可以缩小范围，如设定为数轴的1/5。
对照的设定
阴性对照
阴性对照的设置是流式细胞术中非常重要的一个步骤，每次流式分析时都必须设置阴性对照.设置阴性对照不需要如图4-5所示的3种阴性对照全部设置齐全，一般只需要设置1种阴性对照就可以了.第1种阴性对照是最简单也是最为常用的对照，每次流式分析时多准备-一份样品细胞，不标记任何荧光素偶联抗体，在流式上样时先检测这份样品细胞，设定各个通道的电压，再根据其非特异性荧光信号值标记阴阳性分界线，然后再检测标记有各种荧光素偶联抗体的样品细胞荧光信号值在阴阳性分界线以上的细胞为阳性细胞.当实验要求不高、已进行预实验或者能够确定同型对照的荧光信号与不加同型对照的这种阴性对照结果一致时，就可以采用这种阴性对照的设置.第2种阴性对照设置方法只是一-种理论上的设置方法，是为了便于理解阴性对照的设置原理才列于此处，一般流式分析时不会应用到这种阴性对照.第3种阴性对照的设置方法，称为同型对照设置，是常规的阴性对照设置法，正式的流式图的数据都必须建立在这种同型对照的基础之上，在同型对照基础上得出的流式结果是最可靠的。
FMO对照
减一阴性对照(fluorescence-minus-one control，FMO对照)是一种特殊的阴性对照,是指在多色(通道)分析时对其中某一个通道特别设置的阴性对照,多在研究不同细胞亚群表达某些重要的表型分子、细胞因子等时应用。
如需要研究人PBMC中CD62L*CD4和CD62L-CD4*两个细胞亚群表达CD45RA这个重要表型分子的表达情况时，需要同时标记不同荧光素偶联的抗人CD4、CD62L和CD45RA抗体，除了常规的阴性对照设置，最好再设置一组FMO对照，就是只标记荧光素偶联抗人CD4和CD62L抗体，而不标记荧光素偶联的抗人CD45RA抗体然后将CD62L*CD4*和CD62L-CD4*细胞亚群分别设门，将两群细胞分别显示于新的散点图中，散点图上其中一个轴代表CD45RA的荧光信号，这时就可以分别设置这两个细胞亚群CD45RA通道的阴阳性界线，然后再上样分析实验组，根据不同细胞亚群各自的阴阳性界线分别判定细胞亚群各自表达CD45RA的情况。这种特殊的阴性对照就是FMO对照。
阳性对照
设置阳性对照,就是在使用某种荧光素偶联抗体前先采用一定的方法检测该荧光素偶联抗体是否有效。
阳性对照并不是每次进行流式分析时都必须设置，一般在遇到以下情况时设置:
(1)使用新的荧光素偶联抗体时,该荧光素偶联抗体以前没有使用过。
(2)换用不同公司的或者同一公司但不同批号的荧光素偶联抗体时。
(3)使用储存时间较长的荧光素偶联抗体时。
补偿调节
调节各个荧光通道之间的补偿是流式细胞术非常重要的一个环节,流式分析时补偿是否调节,补偿调节是否正确直接关系到最后流式分析结果的正确与否。初学者尤其要注意流式细胞术补偿调节(fluorescence compensation)的问题,掌握补偿调节原理,学会如何正确调节补偿,这样才能保证流式分析结果的正确。
是否需要补偿调节以及如何具体安排补偿调节与实验目的有关。单色分析标记一种荧光素偶联抗体时,就不需要补偿调节，一般单色分析用FITC通道,标记FITC偶联的抗体,只分析FITC通道接收到的荧光信号的强弱即可,不需要分析其他荧光通道的信号。如果是双色分析，一般采用FITC通道和PE通道,同时标记FITC和PE偶联的抗体,这两个通道之间就需要调节补偿。
补偿调节的原理
流式荧光通道之间需要调节补偿是因为流式荧光素在相应激光激发后发射的荧光波长并不是完全集中于一个很小的范围。如表4-4
为了让FL1代表FITC荧光素的荧光信号，FL2代表PE荧光素的荧光信号,而不是上述的FL1和FL2的荧光信号是由一定比例的FITC荧光信号和PE荧光信号共同组成，流式细胞术用补偿调节的方法实现这个目的:排除FL2中来自于FITC的荧光信号,就是设置“FL2—FL1”(“PE—FITC”)的补偿值，使FL2完全代表PE的荧光信号:排除FL1中来自于PE的荧光信号,即设置“FL1—FL2”(“FITC一PE”)的补偿值,使FL1完全代表FITC的荧光信号。这个过程就是调节补偿的过程。
