miRNA+囊泡套路
知识
miRNA 的转录和转录后的加工成熟，位于供体细胞 miRNA 由一个茎环结构的前体加工而来
miRNA 与结合靶基因 mRNA（发挥生物学功能），发生在受体细胞
miRNA 的经典作用机制是结合下游的靶基因的 mRNA 并抑制 mRNA 的翻译表达
细胞交互+miRNA
数据上有扩充：
1. 供体细胞里面 miRNA 的表达、分泌的情况
2. 包裹在囊泡中的 miRNA 是否被受体细胞接收
3. 受体细胞中 miRNA 结合靶基因的表型 这个工作量相当于是两套 miRNA 靶基因数据集合到一篇文章
☆实操步骤
上一策叫半壁江山半套
这一策可以看成两个半套合成完整一套，可以分成上下两部分数据
上半部（揭示现象、阐释机制）
供体细胞中主变量 miRNA 的表达变化
细胞培养上清中分泌的囊泡数量以及内含的 miRNA 数量
下半部
受体细胞接受囊泡中的 miRNA
明确 miRNA 来自外源导入，并非是受体细胞内合成的增加
在此基础上解释清楚主变量 miRNA 的功能以及它下游的靶基因机制
建立 miRNA 跟疾病相关表型的联系
具体10步
第一步 确认细胞相互交互：用供体细胞的培养上清处理受体细胞，观察受体细胞表型变化 相当于加药，用法和标评价表型是否变化 这步相当于预实验
细胞交互的课题的前提就是存在交互，以此为基础进行后续研究
交互分为：
- 直接接触（不推荐）
2.通过分泌分子或囊泡运输（更有延展性）√
第二步：表达差异
细胞上清样品抽提外泌体送 miRNA 芯片测序，找差异的 candidates list （ 27 策）
在细胞交互课题中，表达差异放在第二步。原因： 1、该课题前体是有交互，否则立论不成立 2、供体细胞上清加到受体细胞，非常简单，不涉及基因操作
第三步，锁定外泌体中差异表达的 miRNA 分子，操作分子(正反回复)看表型，验证功能
1）怎么操作？
√在供体细胞过表达或者沉默 miRNA，然后同样再用细胞上清去孵育受体细 胞，与对照组没有操作分子的培养上清进行比较，看表型是不是被阻断
X 错误的做法：在外泌体上操作主变量，把 miRNA 转染进外泌体这是没法弄的
2）一正或一反，只做阻断 loss of function 就可以
问：为什么这一步不正反回复做全？
我们通常倾向于研究高表达的分子，所以这步一般沉默 miRNA 且细胞交互课题数据量庞大，第三步才刚开始，后面还有重要数据
两种方法：
1 沉默 miRNA
2 用商业化抑制剂阻断外泌体合成必要的酶，或封闭或沉默参与外泌体释放的关 键蛋白(相当于拆运输载体)
第四步，从供体细胞的上清提取、分离并鉴定外泌体（鉴定囊泡）
分离试剂盒：有专门的商业化试剂盒
分离原理：离心、色谱、过滤、基于高分子聚合物的沉淀、免疫亲和分离
鉴定：
透射电镜，观察外泌体形态
动态光散射 DLS，分析颗粒粒径大小，颗粒密度
ZETA 电位，检测颗粒电荷
Western、免疫荧光检测外泌体 marker（组织细胞蛋白）
常见的有热休克蛋白 HSP70，TSG101，cd63，需查文献整理
ELISA 检测体液中的分泌蛋白
注意：western 和 ELISA 都是检测蛋白，但检测的对象不同，前者为体液 中的分泌蛋白，后者为组织细胞蛋白 qPCR、芯片、测序监测非编码 RNA
△第五步，用亲脂性的荧光染料（DII、DID、DIO、DIR）标记示踪外泌体，观察受体细胞的 对外泌体的摄入情况
荧光染料是一些差不多的衍生化合物 荧光染料进入细胞膜前，荧光很多，结合细胞膜后，荧光强度大大增加 荧光进入细胞后，使细胞显色 这步属于鉴定囊泡的特殊步骤，属于细胞交互的特殊配置 如果是 circulating 分子，不经由囊泡，可以直接标记分子观察摄入的情况
第六步，观察受体细胞中的主变量表达变化和表型变化
（逻辑：主变量→表型，单变量表型 论证），但是操作环节在供体细胞
第七步：动物表型验证（非必须）
预防性策略：先分子操作，再打动物
治疗性策略：先制作模型，再直接打分子操作工具
细胞交互课题中，两种策略： 动物水平直接操作分子，改变分子表达产生表型 在供体细胞上操作分子，用供体细胞的培养上清或上清的提取物注射动物 条件更苛刻：不仅需要分子操作，还必须是分泌的才有作用 具真正意义 注意：这一步非必须，通常第六步后是探讨分子机制，建立多元变量调控关系
第八步，先下后上，探索受体细胞 miRNA 靶基因的直接作用机制，或分子加通路的间接机制
MiRNA 靶基因直接机制，同 11 策 Mimics miRNA→靶基因↓ Inhibitor miRNA →靶基因↑ 操作 miRNA+操作靶基因（反正正，反反反）→ 表型回复 ！
不同点：操作主变量或阻断外泌体永远在供体细胞，rescue 操作靶基因或下游 通路在受体细胞
第九步，上游机制，也有直接和间接
解释主变量释放增加的原因：本身表达增加？还是细 胞分泌增加？
1 MiRNA 可以在基因、转录、转录后三个水平来探讨
2 其他的分子类型可以从基因、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平挖掘机制
3 另外，circulating 的分子可以从是直接分泌还是囊泡运输来分泌进行探索 就像分子修饰找上游的酶 因为分子的范围不大，是有限分子的结合 以上的路不一定都能走通，走通一条就可以 ！注意：研究外泌体介导的信号传导过程中，有特异性和非特异性两种作用方式
非特异性是指受体细胞，它什么外泌体都吞，不挑食，来了就吃 特异性作用指外泌体表面有膜蛋白
外泌体表面是一个双层脂质结构，跟细胞膜一样，有膜蛋白（内容物也有蛋白）
这个膜蛋白也可以结合受体细胞膜表面的受体，通过配体受体的结合来增加识 别的特异性，这就把问题进一步复杂化了
如果一篇文章它既没有做供体细胞主变量为什么表达上升，也没有做外泌体的 合成和分泌变化，却探讨了外泌体识别受体的膜蛋白，也是上游机制
第十步，跨空间 rescue
细胞交互是一个多步骤的过程 当分子经由囊泡分泌，阻断囊泡合成、分泌以及靶细胞对囊泡的识别和摄入都可以 设计 rescue。
这个设计目的主要说明该信号传递依赖于囊泡，是必要性论证
外泌体+miRNA 套路之所以看起来复杂，因为有多处操作可以分裂 比如操作主变量这步，如果操作外泌体，效果相同 还兼容直接机制的数据，
如 MiRNA+靶基因就是最简单的直接机制 其他更复杂的蛋白蛋白交互、蛋白 RNA 交互加外泌体的注意事项在下次课降解
！注意：多变量 rescue 设计容易出错 要点：围绕主变量进行设计 细胞交互课题新增一条逻辑证明：变量间的调控关系依赖于细胞交互 因变量与因变量之间的 rescue 设计往往可以省略
