本文选自immunity，https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.02.007，喜欢的朋友可以自行下载阅读。
Dysregulated Expression of the Nuclear Exosome Targeting Complex Component Rbm7 in Nonhematopoietic Cells Licenses the Development of Fibrosis
书接上文，下面我们开始详细学习一下这篇文章具体是怎么做的。。老规矩，先上图。
这种高分文章不容易读懂，而且做的比较复杂，需要拆解一下，首先，Rbm7参与纤维化 ，其次，Rbm7结合到lnc NEAT1中 ，最后 ，lncNEAT1与BRCA1分离，BRCA1下降，细胞凋亡，在最后，细胞凋亡释放细胞因子CXCL12招募SatM,最最后，SatM促进纤维化期进展，最最最后，凋亡细胞释放TGF-b，TNF-a可以刺激成纤维细胞活化为肌成纤维细胞，产生大量细胞外基质，促进纤维化，最最最最后，读完我又再一次倒下了。
首先患者开篇就介绍了纤维化，和我上一篇所叙述的都差不多，总结起来就是，各种原因引起细胞出现损伤，损伤后的修复过程就伴随着纤维化的过程，但是，不同器官出现纤维化对功能影响很大，治疗起来又没有什么好办法，所以，研究一下这个机制很重要（美容科用什么红蓝光软化瘢痕又是什么骚操作）。在纤维化过程中，免疫细胞与其他细胞之间crosstalk起到重要作用，一堆免疫细胞以及非免疫细胞通过释放一些细胞因子如白介素-13，白介素-4，TGF-B等参与到成纤维细胞的活化过程中。作者以前研究发现SatM在纤维化过程中异常重要，这种细胞特征为Ceacam1+Msr1+Ly6C-F4/80-Mac1+，双叶核，有粒细胞的特征。删除Cebpb，可以使造血细胞不形成SatM，同时抑制了BLM诱导的纤维化，但是没有改变炎症反应。本文就间质与SatM如何作用以及SatM与纤维化关系进行了研究。
以前说过存在即合理，那么先研究一下这个东西是不是存在吧，作者用BLM诱导鼠肺纤维化，然后用野生型及晚期纤维化进行比较，发现纤维化鼠肺提取物5中趋化因子表达升高（对不住了各位，有些内容放在补充材料上了，但是，我没找到补充材料，不知道你信不信）。Transwell细胞迁移分析表明，在这些趋化因子中，只有Cxcl12促进SatM募集。与SatM募集的时间一致，肺组织中Cxcl12的表达从晚期开始就响应于BLM给药而逐渐增加，CXCL12的受体CXCR4在SatM上表达。CXCR4抑制剂AMD3000可以抑制SatM的迁移。在给予BLM和抗Cxcl12中和抗体的小鼠中纤维化发展受到抑制。这些小鼠中SatM向纤维化肺的募集减少。总结起来就是，纤维化肺产生Cxcl12，导致SatM募集，随后开始纤维化。 Cxcl12在非造血性肺细胞晚期选择性表达。作者然后在BLM诱导肺纤维化与阴性对照组进行差异蛋白分析，发现了在差异表达的mRNA和蛋白质中，RBM7的表达在晚期阶段增加，但在早期阶段没有增加。与非纤维化对照组相比，患有肺纤维化的患者的肺切片显示进行性纤维化区域的RBM7蛋白表达增加。和肺纤维化相似的是肝和肾同样也出现了Rbm7升高的情况（做这方面的同学们是不是可以请喝茶了）。
RBM7是核外泌体靶向复合物的一个成分，它调节各种类型的RNA的降解，然后作者用了敲除RBM7的转基因鼠，敲除RBM7后对于免疫细胞没有发生改变，作者再次应用BLM诱导纤维化，发现敲除RBM7后，纤维化收到了抑制，组织分析显示纤维化标记羟脯氨酸没有积累。
Rbm7-/-小鼠肺部的BLM诱导的纤维化标记Col1a1和TGF-b1的表达受到抑制。在Rbm7-/-中Cxcl12的表达被抑制。滴注BLM后的小鼠少量的SatM被募集到Rbm7-/-小鼠的肺中
然后，作者又看了看，在RBM7-/-的鼠中肝和肾纤维化情况。果然，表现和肺部一致。（作者都做到这个份上了，同学你还不收下吗？我好像也是做的这个方面啊…………尴尬）
可以明确RBM7在纤维化中的作用了，那么接下来就是要找什么细胞分泌的这个了，作者分了两类，一类是造血细胞，一类是非造血细胞（用CD45进行区分）。Rbm7仅在纤维化阶段优先在非造血细胞中表达（那在炎症阶段呢？）。作者设计了一个非常巧妙的实验，就是先致死性辐照WT和RBM7-/-鼠的骨髓，然后交叉移植RBM7-/-或WT的骨髓，在BLM诱导肺纤维化，大家猜猜哪种鼠会肺纤维化更重。激动死了，上图。
那么，RBM7在非造血细胞中所什么时候开始升高的呢？（我发现了高分文章好像都喜欢做这种什么时候开始升高的实验）只有在纤维化期非造血细胞RBM7才升高。随着纤维化的发展，在小鼠和人肺上皮细胞中大量表达。为了确定Rbm7在纤维化阶段的作用，我们仅在纤维化阶段对WT小鼠施用了针对Rbm7的肺特异性siRNA。 WT小鼠在纤维化阶段对Rbm7的抑制导致纤维化减少，在siRNA处理的小鼠中尽管CXCL12表达受到抑制，但是BLM所致炎症反应只轻度受到影响
将Rbm7siRNA给予已发展成纤维变性的WT小鼠抑制了纤维化进程。前面不是说RBM7在纤维化形成晚期才升高的吗，那么早期增加表达，是不是也增加了纤维化，作者在WT体内异位表达RBM7，发现纤维化程度也增多了，Rbm7在成纤维细胞中的异位表达并未导致纤维化标记Col1a1和Acta2的表达，这表明Rbm7不能直接促进成纤维细胞分化为成肌纤维细胞。
小结一下，说明RBM7促进纤维化，但是RBM7并非直接作用在成纤维细胞上。至此，说明了RBM7在纤维化形成过程中的重要作用。（那么我有个疑问，这个siRNA是怎么作用到RBM7的，其次异位表达RBM7是怎么进入到细胞的？那么我们做体内抑制实验是不是也可以直接注射siRNA，或者我们发现一个蛋白有作用，那么，我们是不是也可以异位过表达这个。）
下面作者又用tunel染色连续切片观察，发现在tunel升高，非造血细胞，包括纤维化区域周围和之中的上皮细胞和内皮细胞，以相似的动力学经历细胞死亡，纤维化标记物表达与晚期轻度炎症相关从纤维化期开始，SatMs就在肺中积累。与Rbm7表达的时间一致，作者发现BLM给药诱导持续的细胞凋亡。是不是太巧了，在纤维化时期RBM7表达多了，凋亡增加了，SatM也增多了。作者在应用BLM后诱导了凋亡，那么抑制凋亡，会抑制纤维化吗？作者应用了抗凋亡药物 Q-VD-OPh而非地塞米松抑制了纤维化并且抑制了SatM迁移。一开始受到损伤等刺激，细胞表现为坏死，作者在这里解释了纤维化早期坏死抑制剂给予坏死性抑素如坏死抑素-1（Nec-1）可抑制纤维化，但是在纤维化期坏死发生非常低，所以即使应用坏死抑制剂，也不能抑制纤维化。（在这里，作者是为了说明一个道理，那就是非造血细胞在启动和维持肺肺纤维过程中重要）此外，在Rbm7缺乏的条件下，与WT小鼠相比，炎性细胞在炎症阶段向受影响区域的迁移几乎没有变化，与注射PBS的对照组相比炎症并未得到完全抑制。（转基因工程鼠确实是高分必备啊）
在纤维化阶段开始时，Cxcl12表达在肺上皮细胞中增加，但在成纤维细胞中没有增加，但后来两种细胞均增加。
在纤维化阶段，WT鼠肺部可见大量坏死，但是在RBM7-/-鼠中并未发现，在肝和肾中也发现了同样的表现。在体内给予siRNA同样也抑制了细胞的坏死。（这个siRNA我也是头一次见这么用的，作者果然是大拿，换成我做，肯定被拒）
缺乏SatM的Cebpbβ-/-嵌合体小鼠和野生型小鼠在纤维化开始时在肺中显示出相当的凋亡（这里做的和上面做RBM7时是一个方式，猜都知道在开始时不会有什么变化，但是在后期肯定是WT移植产生更多的纤维化）
本文体内和表型都做的差不多了，快到机制部分了。刚才说了上皮细胞细胞凋亡，那么RBM7是上皮细胞产生的吗，上皮凋亡和RBM7的关系是什么呢？用依托泊苷处理对RBM7-/-人细胞系的诱导的细胞死亡抗性。此外，在依托泊苷处理后，RBM7-/-细胞中全长RBM7的异位表达挽救了细胞死亡蛋白的表达，证实了RBM7-/-需要诱导细胞凋亡。换句话说，依托泊苷促进凋亡，但是在RBM7缺失时，细胞凋亡受到抑制，但是，加入RBM7时凋亡再次出现，可见，RBM7可以促进凋亡。
作者开始做机制了，然后是二代测序，用敲除RBM7-/-和WT的鼠肺组织，发现稳定报道基因上游的转录物表达，但是没有差异，在凋亡相关通路及基因表达上也没有差异。另一方面，lncRNA和反义RNA的表达，而不是蛋白质编码基因，在WT和RBM7-/-细胞中是不同的。然后作者又作了RIP，为了发现RBM7潜在的靶标。包括NIFK-AS1，MALAT1，n NEAT1_1和这些ncRNA的表达相关的RBM7在RBM7-/-细胞中增加。此外，作者发现两个分析之间有九个分子重叠。然后，作者又用了依托泊苷促凋亡实验，再测序，与原来发现的那9个lncRNA再取交集，发现了NEAT1.（大哥终于上场了）
为了研究这些ncRNA是否与RBM7缺失诱导的细胞死亡抗性相关，作这用了在RBM7-/-和WT细胞中研究了NEAT1-1、NEAT1-2(这两个是报道的在NEAT1启动子共转录的两个转录本)和MALAT1(这个是个明星LNC啊，以前研究肝癌的说是有促癌作用的lnc，参与EMT过程)，作者发现与NEAT1_1类似，在Rbm7-/-细胞中NEAT1_2和MALAT1的表达增加。但是在依托泊苷诱导细胞凋亡中，NEAT1挽救了细胞凋亡，而MALAT1并没有。总结一下关系，敲掉RBM7后，NEAT1升高，RBM7促进凋亡，NEAT1抑制细胞凋亡，RBM7与NEAT1引起凋亡增多的结果，所以，RBM7发挥作用是通过结合NEAT1后发挥的作用，RBM7本身并不能促进凋亡（本实验可以继续验证这个说法，说的好绕啊，我差点没明白）
下面就该紧紧围绕主题说lncNEAT1与纤维化的关系了，那么问题来了，要是你该怎么做，是不是在细胞水平验证NEAT1的表达，然后，在做做工功能试验看看，作者是大拿啊，记得他是怎么敲掉RBM7的siRNA的吗，对了，直接静脉注射。发现了抑制NEAT1可以促进纤维化发展。然后，注射到WT鼠中发现了加速纤维化过程。
既然在RBM7-/-细胞中NEAT1表达升高了，对比WT细胞还存在差异，那么，在RBM7-/-细胞中加入RBM7那NEAT1会回到原来的情况吗？作者在人的RBM7-/-细胞系中作了实验，发现，加了全长RBM7的可以逆转RBM7缺失导致的NEAT1及NEAT1-2的表达增多，但是，加入缺少关键RNA结合位点的RBM7却没有出现这种现象，在鼠RBM7-/-细胞中也发现了NEAT1的升高。这里作者估计为了说明RBM7有NEAT1的结合位点。
为了严格验证与RBM7结合的lncRNA ，作者作了CLIP-PCR,发现NEAT1，NEAT1_2，MALAT1和U1 snRNA（而非TERT）与RBM7严格结合.
RBM7与NEAT1和NEAT1_2部分共定位（作者在补充材料里提供的，不过我没找到啊），表明RBM7与NEAT1 ncRNA降解有关，在以往的研究中发现NEAT1，尤其是NEAT1_2，是准散斑核体的必要结构组成部分。（这个散斑核体又是个什么，简而言之，这种东西存在的时候，就是基因活动活跃的时候。）作者研究了斑点的RBM7和NEAT1和NEAT1_2的定位。与在缺少RBM7的细胞中NEAT1和NEAT1_2RNA衰减减少，NEAT1和NEAT1_2形成的斑点数量增加。此外，在缺乏Rbm7的小鼠肺和人类细胞系中，对NEAT1或NEAT1_2斑点呈阳性的细胞频率增加。
这个实验做到这里，我觉得这个lnc是不是该找找作用片段了，就是打断然后在进行RIP，作者发现RBM7可以结合NEAT1的两个截短的突变体，结构预测分析表明，结合RBM7的每个区域都具有包含特征7U的茎环结构，表明这是RBM7的目标位点。然后突变掉这些茎环结构，在做个RIP，看看能否再pull down，获得的结果表明，NEAT1中的两个位点（487-493和1995-2001）对于RBM7的识别都是至关重要的。在鼠的NEAT1测序发现与人NEAT1 7U片段同源，是结合RBM7的片段。（这为我们做人lncRNA提供思路了，不仅要看人的，还要看动物的，有没有保守序列，要不然不一定做出结果，要不然就是不能够模拟人体的情况。）
我觉得文至此可以结束了，但是作者并没有，NEAT1找到了，在没有RBM7的条件下NEAT1升高了，而且抑制了上皮细胞的凋亡，那么，NEAT1是怎么发挥作用的呢？作者在RBM7-/-细胞中用慢病毒干扰掉NEAT1和NEAT1-2的表达，发现DNA损伤加重了。还发现即使在BLM给药后的纤维化期间，DNA损伤仍继续发生。但是在RBM7-/-中并未发现这种损伤存在。还揭示了即使用中和抗体去除了诸如嗜中性粒细胞和炎性单核细胞之类的炎性细胞，也会发生这种DNA损伤（这里正好回答了我原来的那个疑问）。
为了阐明RBM7缺乏，细胞死亡抑制和NEAT1积累之间的缺失联系，作者研究了NEAT1与DNA损伤反应中涉及的各种蛋白质之间的关联。RNA-免疫沉淀-qPCR分析显示NEAT1与BRCA1的关联，BRCA1是修复受损DNA的关键蛋白，而不是其他DNA修复或细胞死亡相关因子。BRCA1与NEAT1共定位，RBM7-/-细胞比WT HEK293细胞中含有BRCA1和NEAT1的斑点更丰富。除此之外，BRCA1与NEAT1_2副斑点共定位。
与免疫染色数据一致，CLIP-qPCR分析清楚地表明BRCA1与NEAT1_2和NEAT1相关。此外，使用NEAT1探针进行RNA反义纯化（RAP）表明，BRCA1以及RBM7和FUS（后者是一种散斑标记）已与NEAT1严格结合，但未与TERT结合。此外，DNA损伤触发了WT细胞中NEAT1斑点的BRCA1分散，并且shRNA-NEAT1_2和NEAT1敲低细胞中几乎不存在BRCA1的积累（这里又解决了我的另一个疑问，为什么用依托泊苷来诱导凋亡，大牛就是不一样，佩服）
这些结果在鼠的细胞中也具有同样的表现。最后，作者又敲了BRCA1，得到了同样的结果。（作者把BRCA1敲掉在看看下游啊，是不是又能发现新东西了，在找找上游的调控因子，不又能发一篇类似的了，那些做肝纤维化和肾纤维化的你确定不考虑一下吗？）
至此，全文结束，从一开始的不懂，到最后的恍然大悟，果然，还是佩服作者的思路，看来科研道路任重道远，高山仰止，景行行止，大牛的文章，我就不班门弄斧了，欢迎大家批评，指正。
