1. Author
Diamond实验室主要研究方向是RNA分子相关实验，并专注于发病机制和宿主免疫之间的联系。他的实验室通过鉴定一种新的病原体相关分子模式（病毒RNA 5′帽上缺乏2′-O甲基化）和IFIT1蛋白的先天免疫限制机制，做出了一项开创性的发现。此外，他的团队使用全基因组筛查来识别病毒所需的宿主因子，包括全球关注的多种阿尔法病毒的新进入受体。他在研究寨卡病毒感染和疾病（包括妊娠期）的发病机制方面处于领先地位，最近还研究了微生物组如何调节节肢动物传播病毒的免疫和感染。他的团队表征和绘制了数千种针对寨卡病毒、西尼罗河病毒、登革热、马亚罗病毒和基孔肯雅病毒的中和抗体图谱。他的工作为黄病毒和阿尔法病毒的抗病毒治疗抗体和疫苗的开发做出了卓越的贡献。最近，他的实验室已经开始努力研究严重SARS-CoV2的生物学和发病机制，并正在寻求开发抗体和疫苗对策以及新型小鼠疾病模型的策略。
2. Background
2.1 Ⅰ、Ⅱ型肺细胞
1. 仅含核部位略厚，其余部位扁平菲薄，覆盖肺泡约95%的表面积，是进行气体交换的部位；
2. 细胞质中有较多小泡，可将细胞吞入的表面活性物质和微小粉尘转运到间质中清除；细胞之间有紧密连接和桥粒，防止组织液向肺泡渗入；
3. I型肺泡细胞无增殖能力，损伤后由II型肺泡细胞增殖分化补充。
1. 细胞呈立方或圆形，散在凸起于I型肺泡细胞之间，覆盖肺泡约5%表面积；
2. 细胞质富含线粒体和溶酶体，有较发达的粗面内质网和高尔基复合体；细胞核上方有较多板层小体，其内容物为肺泡表面活性物质，可以胞吐方式分泌到肺泡上皮表面，铺展为薄层液体膜，降低肺泡表面张力。
2.2 HFH4-ACE2 小鼠
人源化小鼠是研究人类疾病的重要模型，研究发现小鼠细胞血管紧张素转换酶2(mACE2)不易于被SARS-CoV-2识别，因此构建的人源化hACE2新冠小鼠感染模型被广泛应用于新冠病毒感染相关研究。目前已报道多种人源化hACE2转基因模型小鼠，这些hACE2的表达受Krt8，HFH4，CAG或mACE2启动子驱动。然而Krt8在肺脏主要表达在支气管管腔上皮细胞，HFH4主要表达在支气管纤毛细胞，CAG为广谱型启动子在所有细胞类型表达。 武汉病毒所使用SARS-CoV-2感染HFH4-hACE2小鼠(使用HFH4肺纤毛上皮细胞特异性启动子将hACE2基因转入小鼠中)，通过持续监测小鼠临床症状，观察组织病理变化以及各组织中病毒载量情况，发现感染的小鼠产生了与COVID-19患者类似的间质性肺炎;预先暴露于SARS-CoV-2可以保护小鼠免受病毒的致死感染。该模型的建立为测试潜在疫苗和抗病毒药物提供了有利的工具。实验团队在使用SARS-CoV-2感染小鼠后，发现部分小鼠出现明显的体重降低并最终死亡。小鼠肺部在感染第1天和第3天时就出现少量炎性细胞浸润和纤维蛋白渗出的情况。从感染后5天起，小鼠出现重症和轻症两种不同的表型：重症小鼠(27.3%)肺部展现出严重的血管周-支气管周炎性细胞浸润，伴有部分支气管堵塞和透明膜形成;轻症小鼠肺部炎症反应减轻并逐渐恢复正常。病毒载量结果显示SARS-CoV-2主要感染小鼠的肺组织，但在部分小鼠的眼睛，心脏和脑组织中也发现了病毒RNA。
3. Methods
1. 空斑实验
2. 病毒载量和hACE2表达的测量
3. 细胞因子的mRNA水平检测
4. RNA-Seq
5. 流式细胞术
6. 跑步机压力测试（Treadmill stress test）
7. 组织病理学分析
空斑实验
48-Vero细胞48以2.5×105细胞每孔的密度接种在平底12孔的组织培养板中。第二天，倒去培养基，用200μl的10倍系列稀释液替换（稀释液：DMEM+2%FBS）。一小时后，加入1ml甲基纤维素覆盖。培养板72小时，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用4%多聚甲醛固定20分钟。然后用在20%甲醇中的0.05%（wt/vol）结晶紫染色，并用蒸馏去离子水洗涤两次。
4. Results
实验团队用2.5 × 104个斑块形成单位(p.f.u.)的SARS-CoV-2通过鼻内途径接种8周龄杂合子K18-hACE2两性小鼠。从第4天开始，K18-hACE2小鼠表现出明显的体重下降，到第七天时，大多数动物的体重下降了约25%，许多小鼠开始死亡。在2、4和7 天时，肺匀浆中检测到高水平的传染性SARS-CoV-2和病毒RNA。该模型中支持SARS-CoV-2感染的组织反映了hACE2的表达模式，其受体在肺、结肠、肾脏和大脑中的表达水平最高(扩展数据图1b)。与临床结果相比：肺的感染情况基本相同，但是人体内未出现脑相关的感染。
紧接着作者团队通过简单的病理学染色以及RNA的原位杂交发现：在感染2天后，病毒主要侵染呼吸道上皮细胞和肺泡上皮细胞；在7天后，RNA的水平有明显的下降，可能是因为7天后肺泡细胞被病理性破坏。总而言之K18-ACE2小鼠可以很好的模拟病毒侵袭机体的过程。
综上所述，作者团队发现K18-ACE2小鼠可以很好的模拟病毒侵袭的过程，那么这样的小鼠能不能用于临床研究呢。换言之，测定几个传统的临床指标，观察他们的变化情况。例如：外周的血清学参数以及临床化学参数，发现血浆钠、钾、氯的浓度在感染7天后都有一个明显的降低，但是碳酸氢盐不降反升。这样的现象作者猜测可能是因为病毒破坏了肺部结构，糟糕的气体交换导致的。此外通过测量了小鼠的心肺功能，发现在感染2天后有一个明显的下降趋势。通过系列的生物物理学实验证明了K18-ACE2小鼠的肺顺应性和扩张性降低；存在更大的传导气道的阻力。同时呼吸系统力学特性的测量表明，K18-hACE2小鼠的SARS-CoV-2感染主要导致肺泡和肺实质的疾病，而不是传导呼吸道的疾病。
据推测，SARS-CoV-2感染引起的宿主过度促炎反应是导致某些COVID-19患者出现肺部病理和呼吸窘迫的原因之一。为了评估感染SARS-CoV-2的K18-hACE2小鼠的免疫细胞反应的组成，研究团队在鼻内接种病毒后的三个时间点对肺匀浆和支气管肺泡灌洗液(BAL)进行了流式细胞术分析，发现：从第二天开始，在BAL中CD45+免疫细胞的数量呈上升趋势，在第四天时肺中CD45+免疫细胞的数量呈上升趋势。第4、7天时肺浸润细胞主要由髓系细胞亚群组成，包括Ly6G+中性粒细胞、Ly6C+单核细胞和CD11b+CD11c+树突状细胞。在BAL液中，单核细胞数量在第四天达到峰值，中性粒细胞和树突状细胞水平在第7天时持续上升。BAL液中单核细胞的积累与组织内肺泡巨噬细胞数量的减少相一致，这一观察结果与COVID-19重症患者BAL液的单细胞RNA测序(RNA-seq)分析一致。在第七天时，作者团队还观察到肺内几个淋巴样细胞亚群的增加，包括NK1.1+自然杀伤细胞、γδ CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞和活化的CD44+CD3+CD8+T细胞。炎症因子也存在着一定的变化规律，这边就不过多介绍。（详情见Figure）
有了这样一个强有力的科研工具以后，可以进行诸多实验的开展，作者抛砖引玉的对感染小鼠做了时序性的转录组分析，试图研究研究感染动力学和继发炎症如何调节细胞因子IFN对SARS-CoV-2的反应。比较后发现许多基因存在差异，比如：IFN信号转导、核因子-κ b依赖的细胞因子或白细胞活化相关基因。参与细胞因子介导的信号转导、中性粒细胞激活、II型IFN和toll样受体信号转导的细胞应答的基因集上调在感染第7天时最为显著。I型IFN信号通路中不同基因在2和4 dpi(如Irf9、Irf7、Stat1和某些IFN刺激基因(ISGs): Isg15、mx、Oas3、Ifit1、Ifit2和Ifit3)相对于7 dpi(如Ifnar1/2、Tyk2、Irf1和某些ISGs: Samhd1、Oas2和Ifitm1)上调。另外，IFN和ISG信号在早期和晚期时间点的差异可能反映了I型、II型和III型IFN信号的差异贡献。
