6+生信，基于特定基因家族进行单细胞和空转的分析，这图是真多，组图是真密啊！

一、文章信息

发表杂志名称：Cell & Bioscience
中文标题：肿瘤中GDF家族的单细胞和空间分析：聚焦GDF15在肝细胞癌中的预后价值及生物学功能
英文标题：Single‑cell and spatial analyses of the GDF family in tumors, with a focus on the prognostic and biological role of GDF15 in hepatocellular carcinoma
影响因子：6.2
发表日期：2025年6月27日

二、研究概述

生长分化因子（GDFs）是转化生长因子-β（TGF-β）超家族的亚家族，在细胞应激和疾病状态下表达升高。尽管已有细胞或动物实验表明GDF亚家族与癌症相关，但缺乏基于单细胞和空间转录组的泛癌系统分析。本研究对33种癌症中GDF亚家族进行了全面分析，涵盖表达、诊断、甲基化、预后价值、免疫浸润及潜在生物学通路。重点结合多组学单细胞测序（scRNA-seq）和空间转录组数据，探究GDF家族在肝细胞癌（HCC）肿瘤微环境（TME）中的作用及免疫治疗适用性，并通过功能获得与缺失实验验证GDF15在HCC细胞系中的功能。研究发现GDF亚家族在多数肿瘤中差异表达且与患者预后相关，HCC中GDF15阳性肝细胞分化程度低，可促进细胞增殖和侵袭，与癌相关成纤维细胞（CAFs）来源的骨膜蛋白（Periostin）相互调控促进肝癌发生，且GDF15表达与免疫浸润呈负相关。该研究为GDF亚家族的致癌作用提供了全面视角，凸显了GDF15在HCC中的关键作用，为癌症诊断和治疗提供了生物标志物及潜在靶点。

三、研究目标与解决的实际问题

（一）核心研究目标

系统解析GDF亚家族在33种癌症中的表达特征、遗传变异、甲基化状态及预后价值，构建泛癌诊断和预后模型。
基于单细胞和空间转录组技术，揭示GDF家族在HCC肿瘤微环境中的细胞分布、异质性及细胞间相互作用机制。
明确GDF15在HCC中的生物学功能，包括对肿瘤细胞增殖、侵袭的影响及对免疫细胞（尤其是巨噬细胞）极化的调控作用。
探索GDF亚家族与药物敏感性的关联，为癌症精准治疗提供潜在靶点。

（二）解决的实际问题

填补了GDF亚家族泛癌多组学分析的空白，解决了其在肿瘤中诊断和预后价值不明确的问题。
阐明了GDF15在HCC发生发展中的具体作用及分子机制，为HCC的早期诊断提供了新型生物标志物。
揭示了GDF15对肿瘤免疫微环境的调控作用，解释了部分癌症患者免疫治疗响应不佳的原因，为优化免疫治疗策略提供了理论依据。
筛选出与GDF亚家族相关的潜在治疗药物，为癌症精准用药提供了参考。

四、研究方法与目的

（一）生信分析方法及目的

分析类型	具体方法	核心目的
泛癌表达分析	利用TCGA、GEO数据库，结合UCSC Xena、GSCA等工具	检测GDF亚家族在33种癌症中的差异表达
遗传变异分析	从GSCA、MEXPRESS获取SNV、CNV及甲基化数据	明确GDF亚家族基因变异特征及对表达的影响
诊断/预后模型构建	LASSO回归、COX回归、Nomogram模型	建立基于GDF亚家族的癌症诊断和预后评估工具
功能富集分析	GO/KEGG富集、GSEA分析	探究GDF亚家族相关的生物学通路和功能
免疫浸润分析	CIBERSORT、EPIC、TIDE算法	分析GDF亚家族与肿瘤免疫细胞浸润及免疫治疗响应的关联
药物敏感性分析	结合GDSC、CTRP、PRISM数据库，分子对接（AutodockVina）	筛选对GDF亚家族敏感的潜在治疗药物

（二）实验验证方法及目的

实验类型	具体方法	核心目的
基因表达检测	qRT-PCR、IHC、免疫荧光染色	验证GDF15在HCC细胞系和组织中的表达水平
细胞功能实验	MTT assay、3D基质胶培养、划痕实验、Transwell实验	检测GDF15对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响
功能调控实验	重组GDF15蛋白处理、GDF15中和抗体、siRNA干扰、基因敲除	通过功能获得/缺失验证GDF15的生物学功能
免疫细胞实验	小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）分离、流式细胞术	探究GDF15对巨噬细胞极化的调控作用
动物实验	原位HCC小鼠模型（Hepa1-6-luc细胞）、AAV8介导GDF15过表达	验证GDF15在体内对肿瘤生长的影响

（三）单细胞与空间转录组分析方法及目的

分析类型	具体方法	核心目的
单细胞数据处理	Cell Ranger预处理、Seurat包聚类、Harmony算法批次校正	解析肿瘤组织中细胞异质性，鉴定GDF15表达的细胞亚型
细胞轨迹分析	Monocle2、CytoTRACE	揭示GDF15阳性细胞的分化状态和发育轨迹
细胞间相互作用分析	CELLPHONEDB、CELLCHATR包	分析GDF15阳性细胞与其他细胞的信号通路交流
空间转录组分析	10× Visium技术、反卷积分析、Spearman相关性分析	明确GDF15表达的空间分布及与免疫浸润的空间关联

五、实验/分析设计与结果解读（按Figure顺序）

（一）GDF亚家族基因表达分析（Figure 1）

设计逻辑

先通过泛癌数据库明确GDF亚家族的整体表达特征，再利用单细胞和空间转录组技术聚焦其在肿瘤组织中的细胞定位和空间分布，为后续功能分析奠定基础。

结果解读

Figure 1A-B：TCGA数据库分析显示，GDF亚家族多数成员在泛癌中表达升高（如GDF15在13种癌症中高表达，GDF11在14种癌症中高表达），部分成员表达降低（如GDF7、GDF5在多种癌症中低表达），癌与癌旁配对样本结果一致。
Figure 1C：单细胞数据分析表明，GDF亚家族成员在肿瘤组织中呈细胞特异性表达，如GDF1在胶质瘤的AC样恶性亚群高表达，GDF2在NSCLC的单核/巨噬细胞亚群高表达。
Figure 1D：空间转录组分析显示，GDF家族在肿瘤中表达具有多样性，但主要集中在肿瘤细胞和上皮细胞中。

（二）GDF亚家族的诊断价值与模型构建（Figure 2）

设计逻辑

基于表达数据评估GDF亚家族成员的诊断潜力，通过LASSO回归和Logistic回归构建诊断模型，并验证模型准确性，解决癌症早期诊断标志物缺乏的问题。

结果解读

Figure 2A：ROC曲线分析显示，GDF亚家族单个成员在多种肿瘤中具有高诊断准确性，其中GDF2在胆管癌（CHOL）中的AUC值达1.0。
Figure 2B-C：通过LASSO算法筛选出HCC诊断相关的GDF家族成员，构建lasso.risk.score诊断模型。
Figure 2D-F：该LASSO模型的ROC曲线、PR曲线和校准曲线均显示其诊断效能优于单个成员，准确性高。
Figure 2G-K：基于GDF3、GDF5等7个成员构建Logistic回归诊断列线图，但其诊断效能低于LASSO模型。

（三）GDF亚家族的遗传变异与甲基化分析（Figure 3）

设计逻辑

探究GDF亚家族表达异常的分子机制，从基因突变、拷贝数变异和甲基化修饰三个层面分析，明确遗传和表观遗传因素对其表达的调控作用。

结果解读

Figure 3A-D：SNV分析显示，GDF亚家族在皮肤黑色素瘤（SKCM）中突变频率最高，错义突变是主要变异类型，GDF5和GDF2的SNV比例最高（22%），基因突变影响患者预后。
Figure 3E-G：CNV分析表明，GDF家族成员在肿瘤中存在扩增或缺失，以杂合扩增和缺失为主，纯合变异较少，CNV异常与患者预后相关。
Figure 3H-I：甲基化分析显示，GDF1、GDF10等在多数肿瘤中高甲基化，GDF5在多数癌症中低甲基化，且多数成员的mRNA表达与甲基化水平呈负相关，甲基化状态影响患者预后；进一步分析发现HCC中GDF15的甲基化水平在癌组织中低于正常组织，部分甲基化位点与表达负相关。

（四）GDF亚家族的预后模型构建（Figure 4）

设计逻辑

基于COX回归分析GDF亚家族与患者预后的关联，构建HCC预后模型和列线图，结合临床病理参数提升模型的临床适用性，为患者预后评估提供工具。

结果解读

Figure 4A-B：通过LASSO回归筛选出8个与HCC预后相关的GDF家族成员（GDF9、GDF7等），基于风险评分将患者分为高风险和低风险组。
Figure 4C-G：生存分析显示高风险组预后更差，校准曲线验证模型预测准确性，DCA分析表明模型具有较高临床应用价值。
Figure 4H-N：整合GDF亚家族基因表达与TNM分期、年龄等临床病理参数构建预后列线图，ROC曲线、校准曲线和DCA均证实其良好的预后预测效能，且在DSS、PFI等结局指标中同样适用。
补充分析：GDF15单独作为HCC预后标志物具有一定效能，其与临床参数结合的列线图诊断效能更优，且在多因素COX回归中证实GDF15是独立预后因素。

（五）GDF亚家族的功能富集分析（Figure 5）

设计逻辑

通过功能富集分析挖掘GDF亚家族参与的生物学通路，明确其在肿瘤发生发展中的分子机制，为后续功能验证提供方向。

结果解读

Figure 5A：STRING数据库获取GDF亚家族相关蛋白，构建蛋白相互作用网络。
Figure 5B-E：GO分析显示相关基因主要参与BMP信号通路、蛋白激酶复合物、细胞因子活性等过程；KEGG分析表明其显著富集于胰腺癌、结直肠癌等癌症通路。
Figure 5F-J：HCC中GDF15高表达组与低表达组差异分析显示，140个基因上调、127个基因下调；上调基因富集于Wnt信号通路等，下调基因富集于铁离子结合、脂肪酸代谢等过程。
Figure 5K-N：GSEA分析证实GDF15与癌症、免疫、代谢相关通路密切相关。

（六）HCC的单细胞转录组分析（Figure 6）

设计逻辑

整合多组HCC单细胞数据集，解析肿瘤组织细胞组成，聚焦GDF15阳性肝细胞的分化状态、细胞间相互作用及功能特征，揭示其在肿瘤微环境中的作用。

结果解读

Figure 6A-C：整合4个单细胞数据集，获得90,444个细胞，聚类为11个亚群，鉴定出T细胞、巨噬细胞、肝细胞等9种细胞类型。
Figure 6D-E：GDF15主要在肝细胞中表达，且GDF15阳性肝细胞（GDF15_Hepatocytes）主要存在于HCC样本中。
Figure 6F-G：伪时间轨迹分析显示，肝细胞分化过程存在7种状态，GDF15_Hepatocytes处于分化早期，分化程度低，干细胞样特征显著（CytoTRACE验证）。
Figure 6H-J：差异基因热图和GO分析显示，GDF15_Hepatocytes相关基因参与细胞周期、肿瘤坏死因子受体活性等过程；HCC标志物（AFP）、干细胞标志物（EPCAM）在GDF15_Hepatocytes中高表达，肝细胞标志物（ALB）低表达，提示其恶性程度更高。
Figure 6K-Q：细胞间相互作用分析显示，与正常组织相比，肿瘤组织中GDF15_Hepatocytes与其他细胞的通讯强度增强，尤其是与成纤维细胞之间的PERIOSTIN信号通路（成纤维细胞分泌Periostin，GDF15_Hepatocytes特异性接收），且GDF15+Periostin+双阳性患者预后最差。

（七）其他癌症的单细胞与细胞通讯分析（Figure 7-8）

设计逻辑

扩展研究范围，验证GDF15在乳腺癌（BRCA）、胰腺癌（PDAC）等其他癌症中的作用模式，明确其功能的泛癌普遍性。

结果解读

Figure 7（BRCA、PDAC）：

BRCA中GDF15在恶性细胞中高表达，GDF15阳性恶性细胞分化程度低，与成纤维细胞通过COLAGEN、FN1等通路强通讯，促进肿瘤侵袭。
PDAC中GDF15在导管细胞中高表达，处于未分化状态，成纤维细胞通过COLAGEN通路与GDF15阳性导管细胞通讯，促进肿瘤进展。

Figure 8（CRC、LSCC、NSCLC、OV、PRAD）：

GDF15在这些癌症的恶性细胞中特异性高表达，GDF15阳性恶性细胞的细胞间通讯活性增强。
机制上，CRC、NSCLC等中GDF15阳性细胞通过分泌MIF与免疫细胞表面CD74/CXCR4结合，构建免疫抑制微环境；OV中通过MK通路诱导免疫逃逸；LSCC中通过ANNEXIN通路促进巨噬细胞M2极化。

（八）GDF亚家族的免疫浸润分析（Figure 9）

设计逻辑

结合空间转录组和批量测序数据，分析GDF亚家族与免疫浸润的关联，明确其对肿瘤免疫微环境的调控作用，为免疫治疗提供参考。

结果解读

Figure 9A-B：空间转录组分析显示，GDF家族AUC评分与CD4+T细胞、CD8+T细胞等免疫细胞浸润呈负相关。
Figure 9C-J：GDF15表达与HCC肿瘤细胞含量正相关，与免疫细胞浸润（尤其是幼稚B细胞、活化肥大细胞、M1型巨噬细胞）呈负相关。
Figure 9K-M：GDF15高表达组免疫检查点分子（CSF1R、CTLA4、PDCD1等）表达升高，免疫抑制微环境特征显著。
Figure 9N：TIDE分析显示，GDF15高表达组患者免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗逃逸风险更高，免疫治疗响应不佳。

（九）GDF15的功能验证实验（Figure 10-11）

设计逻辑

通过细胞实验和动物实验验证生信分析结果，明确GDF15对肿瘤细胞功能和巨噬细胞极化的调控作用，证实其致癌功能。

结果解读

Figure 10（细胞实验）：

qRT-PCR和IHC证实HCC细胞系和组织中GDF15表达高于正常对照。
重组GDF15蛋白处理促进HCC细胞（Huh7）和正常肝细胞（Lo2）的增殖、迁移和侵袭；GDF15中和抗体或siRNA干扰则抑制HepG2细胞的上述功能。

Figure 11（动物实验与免疫细胞实验）：

GDF15敲除显著抑制HCC细胞迁移和侵袭；原位HCC小鼠模型中，AAV8介导GDF15过表达促进肿瘤生长。
GDF15促进巨噬细胞向M2型极化（CD206+细胞增多，CD86+细胞减少），体外实验证实GDF15下调M1标志物iNOS表达，上调M2标志物CD206表达。

（十）GDF亚家族的药物敏感性分析（Figure 12）

设计逻辑

基于数据库筛选与GDF亚家族相关的敏感药物，通过分子对接验证药物与蛋白的结合能力，为临床治疗提供潜在药物靶点。

结果解读

Figure 12A-B：GDSC和CTRP数据库分析显示，GDF15表达与BRD-K70511574等药物敏感性正相关，与17-AAG等药物敏感性负相关；GDF9、GDF11等成员也与多种药物敏感性相关。
Figure 12C-D：PRISM数据库筛选出HCC中与GDF15相关的Top10药物（如多非利特、戈伐替尼），GDF15高表达组对多数化疗药和靶向药敏感性升高。
Figure 12E-H：分子对接结果显示，GDF11与17-AAG、替尼泊苷结合亲和力高（结合能＜-5 kcal/mol），GDF5与拓扑替康、YM201636结合活性良好。

六、研究总结

本研究通过泛癌多组学分析、单细胞与空间转录组技术及体内外实验，全面系统地探究了GDF亚家族在肿瘤中的作用。研究首次明确了GDF亚家族在33种癌症中的表达特征、遗传变异和甲基化状态，构建了具有临床价值的诊断和预后模型。重点阐明了GDF15在HCC中的关键作用：GDF15阳性肝细胞分化程度低、恶性程度高，通过与CAFs来源的Periostin相互调控促进肝癌发生，同时诱导巨噬细胞M2极化、抑制免疫细胞浸润，构建免疫抑制微环境。此外，GDF15在BRCA、PDAC等多种癌症中均通过类似机制促进肿瘤进展，具有泛癌致癌功能。研究还筛选出与GDF亚家族相关的潜在治疗药物，为癌症精准治疗提供了新方向。尽管存在药物敏感性分析基于细胞系数据、缺乏前瞻性队列验证等局限性，但本研究仍为GDF家族在肿瘤中的诊断、预后评估和治疗提供了全面的理论依据和实验支持，为后续临床转化研究奠定了基础。