先导编辑器（Prime E）的递送和优化由于其较大的尺寸和复杂受到了限制。尽管分离式的基因组编辑工具可以缩小结构的大小，但它们需要特殊的手段将结合和催化结构域连接在一起。
该文章报道了一种分离式PE（sPE），其中Cas9切口酶（nCas9）与逆转录酶（RT）保持分离。sPE在精确编辑方面显示出与初始未拆分PE3相似的效率，并且插入-删除（indel）的副产物没有增加。通过将sPE注射递送到小鼠肝脏以修饰β-catenin，驱动肿瘤形成的效率与PE3类似。用两种腺相关病毒（AAV）载体纠正了I型酪氨酸血症模型小鼠的致病突变。类似地，先导编辑引导RNA（pegRNA）可以拆分为单个引导RNA（sgRNA）和环状RNA RT模板，增加了sPE系统的灵活性和稳定性。
传统的PE2系统，其大小超出了AAV的包装容量。实验者将PE2的nCas9蛋白和RT酶拆分为两部分进行分别表达。那么，如何将分离式的nCas9蛋白与RT酶偶联在一起？实验者设计了MCP（MS2外壳蛋白）与MS2，scFv单链抗体两种方式。
如上图所示，首先是MCP-MS2，实验者将MCP与分离式的RT融合表达，再在nCas9 RNP tracrRNA上添加一个MS2序列，添加位置位于不同的loop结构上及末端，pegRNA2.0和pegRNA1.0-2×MS2则添加了2个MS2序列。
第二种方法则是SunTag scFv系统，实验者将GCN4与nCas9的N端和C端分别融合表达，RT酶则挂载scFv单链抗体，以实现RT与nCas9的偶联。
实验者通过转换过早终止的密码子表达mCherry测试上述Split PE、SunTag-PE3和MS2-PE3系统的编辑效率。RTT为pegRNA的RT模板，PBS为prime binding site。
通过测试实验者发现，MS2-PE3编辑效率最高的为nCas9+MCP-RT+pegRNA1.1，而SunTag-PE3编辑效率较高的为N端融合SunTag的系统，但其编辑效率低于传统PE3。因此实验者后续的MS2-PE都使用nCas9+MCP-RT+pegRNA1.1系统，SunTag-PE使用N端融合SunTag的系统，未添加任何偶联原件的系统sPE作为对照组。
通过测试实验者意外的发现sPE的编辑效率与MS2-PE3相当，比SunTag-PE3高，且与传统PE3编辑效率相当。
实验者又通过在HEK293T细胞的HEK3位点安装“CTT”，对PE3、Split PE、SunTag-PE3和MS2-PE3进行Sanger测序和EditR定量。结果发现Split PE效果大于SunTag-PE3和MS2-PE3。
进一步检测较大删除或者插入效率，引入红绿荧光报告模型，该模型是一个39bp到18bp的替换和47bp的删除。
使用红绿荧光报告模型细胞，MS2-PE3和Suntag-PE3的表现差强人意。
实验者在更多的基因位点上测试了MS2-PE3和Suntag-PE3，总体的编辑效果低于PE3。因此试图在sPE3上进一步优化。
在对sPE系统优化的尝试中，实验者首先更换了另外两种RT酶——E.r.matuase RT和Gsl-IIC RT，以测试其编辑效率。结果表明E.r.matuase RT和Gsl-IIC RT作为原件的sPE系统编辑可以成功发生编辑，但效率低于MLV RT。
实验者又构建了dCAS9，也就是熟悉的Cas9D10A+H840A和RTΔYVDD，在FANCF基因座上进行3-nt的碱基替换。结果表明，切口酶nCas9H840A对于sPE系统是不可或缺的。
动物实验中，实验者使用sPE删除Ctnnb1（β-catenin）中S45的密码子，通过尾静脉注射促使成年FVB小鼠形成肿瘤。
注射后四周，PE3系统平均每只小鼠产生9.75±2.5个肿瘤（n=4），而sPE诱导每只小鼠12.2±3.3个肿瘤（n=5）。IHC染色证实了肝肿瘤中β-catenin的致癌突变激活，扩增子深度测序证实了PE3-和sPE处理组中Ctnnb1中精确的3-bp缺失。表明sPE能够在体内进行精确高效的编辑。
实验者将sPE包装成AAV注射入富马酸乙酰乙酸水解酶（Fah）的功能缺失（G＞A）突变引起的I型酪氨酸血症模型小鼠。Fah是酪氨酸分解代谢途径的关键酶，其缺失会导致肝细胞毒素积聚和肝损伤。Fah突变小鼠需要持续补充2-1,3-环己烷二酮（NTBC），以防止体重减轻。
在Fah突变小鼠中，静脉注射双AAV成功阻止了体重减轻。NTBC停药后24天处死的小鼠肝细胞Fah基因座通过深度测序进行精确编辑确认。这种递送方法的编辑效率相对较低（1.3%），有待于进一步的pegRNA和nick sgRNA优化。
作者认为既然nCas9和RT可以分离，那pegRNA是否可以继续拆分？因此，产生上图的思路。RTT+PBS加MS2的适体，可以偶联到MCP-RT上去。使用核酶+RtcB环化RTT+PBS，以增加其丰度。
根据MS2添加的位置不同，分为petRNA和petRNA-3’。后续的测试表明petRNA的编辑效果更好。
没有MCP和MS2适配体的分离式pegRNA的编辑水平，均低于pegRNA。所以，如果想使用分离式pegRNA，一定要添加适配体。
Northern印迹显示pegRNA和petRNA的完整性和丰度。这些数据表明，环状的petRNA在RNA完整性和丰度方面优于pegRNA，这对sPE编辑效率和保真度都至关重要。
实验者还更换了不同的Cas9进行测试，上图中spCas9和sauCAS9共用一个切口位置，均得到了相当的编辑效率。
该结果表明，可以使用替代的切口酶，同时得到令人满意的编辑效率。同源nCas9或非CRISPR–Cas模块的潜在用途可能会将系统PAM为NGG的限制中解放出来，并为PE编辑的设计提供更多灵活性。
最后，实验者将sPE和PE2系统中的Cas9切口酶和RT反转录酶全部使用IVT-RNA的方式，递送至细胞进行测试，发现全部使用RNA的sPE系统和PE3系统都能够产生精确的编辑结果。而使用体外孵育的RNP（ribo-nucleo protein）也可以在细胞内产生精确的编辑。
总之，该文章为我们展示出PE3可分离式编辑系统的强大的灵活性，无论是蛋白还是RNA都可以进行分离且得到精确的编辑结果。分离式的最大好处就是能够进一步减少相关蛋白的包装尺寸和递送效率。另外，分离的各部分蛋白原件，无论是使用表达蛋白的质粒DNA，还是中间产物RNA，都具有较好的编辑效率。pegRNA的进一步拆分也为我们设计PE3编辑系统提供了一个新的思路。
