发表杂志名称：Briefings in Bioinformatics
中文标题：ISENICS：一种识别衰老免疫细胞和样本并表征其在肿瘤微环境中作用的模型
英文标题：ISENICS: a model for identifying senescent immune cells and samples and characterization of their roles in tumor microenvironment
影响因子：7.7
发表日期：2025 年 8 月 31 日
01# 二、研究概述
衰老免疫细胞会分泌多种炎症因子，削弱机体抗肿瘤能力并促进肿瘤细胞增殖转移，而肿瘤细胞也会通过多种机制加速免疫细胞衰老，但目前缺乏量化不同免疫细胞类型衰老水平的指标。为此，作者开发了 ISENICS 模型（识别衰老免疫细胞和样本的模型），旨在探究衰老免疫细胞在肿瘤免疫微环境（TIME）中的作用。该模型整合 bulk 和单细胞 RNA-seq 数据，借助反卷积算法构建了 23 种癌症类型的免疫细胞基因表达谱。研究发现，肿瘤样本的衰老水平高于正常样本，单核细胞 / 巨噬细胞易与其他细胞亚型共衰老；高、低免疫细胞衰老评分组的差异表达基因富集于衰老通路，免疫衰老水平较高的患者预后更佳；在单细胞水平，多数癌症中免疫细胞衰老后细胞间相互作用的数量和强度增加，且含衰老免疫细胞的样本免疫治疗响应较差。该研究加深了对 TIME 中衰老免疫细胞的理解，为揭示免疫细胞衰老与免疫特征的癌症特异性关系提供了思路，并提供了识别衰老免疫细胞的模型。
01# 三、研究结果
（一）不同癌症类型细胞特异性基因表达谱的反卷积结果
作者通过 TISCH 数据库获取了 23 种癌症类型的单细胞数据，并将其注释为恶性细胞、基质细胞和免疫细胞三类。由于 TISCH 注释存在偏差，不同癌症的细胞类型分布存在差异，且部分亚型具有癌症特异性，但免疫细胞在多数癌症类型中均有发现，其中单核细胞 / 巨噬细胞（Mono/Macro）在 91% 的癌症类型中被注释到（图 2A）。随后，作者构建了涵盖 17 种细胞类型（包括 12 种免疫细胞类型）的 190 个细胞特异性反卷积基因表达谱，并对 TAPE 算法进行验证：一方面，从匹配的癌症-细胞类型组合中获取的反卷积矩阵对，有 76.7%（56/73）表现出显著的一致性（图 2B）；另一方面，文献中获取的所有细胞类型的标记基因在反卷积基因表达谱中均呈高表达（图 2C）。综上，作者成功构建并验证了不同癌症类型的细胞特异性基因表达谱，同时也指出了整合 bulk 和单细胞 RNA-seq 以解析细胞特异性表达谱面临的技术挑战。
（二）基于 ISENICS 对不同癌症类型组织和细胞衰老水平的综合测定结果
作者构建了新型模型 ISENICS 以量化衰老免疫细胞，并提出假设：细胞衰老水平越高，衰老阳性和衰老阴性基因集的活性差异越大。通过对比现有衰老基因集（SenMayo、siAge、SenCID），发现 CellAge 特征在识别衰老免疫细胞方面表现更优，且与 SASP 基因表达显著相关，因此将 ICSS（免疫细胞衰老评分）定义为 CellAge 基因集中两类基因集的差异（图 3A 相关分析基础）。作者分析了 8436 个肿瘤样本、681 个肿瘤邻近组织样本和 5265 个正常样本，发现组织特异性的细胞衰老异质性：多数癌症中，正常样本或肿瘤邻近样本的细胞衰老评分高于肿瘤样本，泌尿系统癌症（KICH、KIRC、PRAD）衰老评分较高，造血系统癌症（DLBC、LAML）衰老评分较低，但 LAML 肿瘤样本的衰老水平高于正常造血组织（图 3A）；免疫组化染色显示，年轻正常结肠组织中 p16/p21 蛋白表达高于老年结直肠癌（COAD）组织（图 3B）。此外，细胞衰老评分分布符合正态分布，表明其数值方差较小（图 3C）；作者根据衰老水平将免疫细胞亚型分为高、中、低 ICSS 组，通过 Circos 图展示了不同癌症和细胞类型的细胞衰老评分异质性（图 3D）；对比衰老样本与非衰老样本的 ICSS，发现衰老样本的 ICSS 显著更高（图 3E）。在细胞共衰老分析中，作者通过癌症特异性背景下的细胞衰老评分相关网络量化细胞共衰老，发现 Mono/Macro 细胞的共衰老连接性最强，累积相互作用强度最高，T 细胞在泛癌水平上与多种免疫群体表现出明显的共衰老，且这种共衰老在结直肠癌（COAD）中最为显著（图 3F）。综上，作者通过 ISENICS 模型全面测定了不同癌症类型组织和细胞的衰老水平，揭示了组织特异性衰老异质性、细胞共衰老特征及肿瘤细胞可能通过免疫逃逸维持低衰老水平的机制。
（三）衰老与非衰老免疫细胞及样本的差异表达基因（DEGs）识别结果
为探究 ICSS 异质性对 TIME 的影响，作者分析了反卷积免疫细胞表达谱，识别出 ICSS 组间的 DEGs，并通过点图展示了每种免疫细胞类型在高、低 ICSS 组间的前 5 个 DEGs，同时用百分比条形图呈现了不同免疫细胞组中上调和下调基因的比例及数量（图 4A）。对高、低 ICSS 组间 DEGs 进行通路富集分析，发现其显著富集于免疫细胞分化、细胞增殖、迁移、黏附及代谢相关通路，这些通路均可能因衰老发生显著改变（图 4B），而这些变化会导致免疫细胞对肿瘤的应答减弱，进而引发慢性低度炎症（“inflammaging”）。韦恩图分析显示，衰老免疫细胞相关基因与免疫功能相关基因及免疫检查点（ICP）基因存在显著重叠，经超几何检验验证了重叠的显著性（图 4C）。在具体细胞类型中，增殖性 T 细胞（Tprolif）的 DEGs 数量最多，作者通过火山图展示了胰腺癌（PAAD）Tprolif 细胞在 ICSS 组间的 DEGs 的 log2 倍变化，其中高 ICSS 组中 CDKN2A（p16）和 CDKN1A（p21）表达上调（图 4D）。对于肿瘤样本，曼哈顿图显示不同癌症中 HSTIME（高衰老肿瘤免疫微环境）和 LSTIME（低衰老肿瘤免疫微环境）样本的 DEGs 数量存在差异，其中膀胱癌（BLCA）、胶质母细胞瘤（GBM）、肝癌（LIHC）和甲状腺癌（THCA）的 DEGs 数量最多（图 4E）。综上，作者成功识别出衰老与非衰老免疫细胞及样本的 DEGs，并揭示了这些 DEGs 涉及的通路及其与免疫功能、ICP 基因的关联，为理解衰老免疫系统功能障碍及寻找衰老相关疾病治疗靶点提供了依据。
（四）基于 ISENICS 的 TCGA 肿瘤患者 HSTIME 与 LSTIME 分类及相关分析结果
作者分析了 23 种癌症类型中样本 ICSS 与免疫浸润水平的相关性及显著性，通过热图展示结果：多数癌症（18/23）中 ICSS 与免疫浸润呈正相关，但在肾癌（KIRC）和甲状腺癌（THCA）中呈负相关；同时，ESTIMATE 数据显示，除 KIRC 和 THCA 外，ICSS 与基质评分、免疫评分、ESTIMATE 评分呈正相关，与肿瘤纯度呈负相关（图 5A）。基于 ICSS 与肿瘤样本免疫浸润的正相关关系，作者进一步探究了 HSTIME 和 LSTIME 患者在免疫和生存方面的差异：箱线图显示，在 23 种癌症类型中的 7 种中，HSTIME 患者的免疫相关基因 GSVA 评分显著高于 LSTIME 患者（图 5B）；生存分析表明，免疫衰老水平较高的患者预后更佳，经 FDR 校正 P 值后，KIRC（P=0.0034）、急性髓系白血病（LAML，P=0.0003）、皮肤黑色素瘤（SKCM，P=0.0004）和 THCA（P=0.01）患者的生存差异显著；将 23 种癌症类型的样本整合后，HSTIME 患者仍比 LSTIME 患者具有更好的生存趋势（P=0.0003），Kaplan-Meier 曲线及 log-rank 检验量化了这些生存差异（图 5C）。综上，作者完成了 TCGA 肿瘤患者 HSTIME 与 LSTIME 的分类，揭示了两类患者在免疫相关基因表达和生存预后上的差异，其结果与肿瘤样本通过衰老逃逸机制维持恶性表型的理论相符。
（五）单细胞水平上衰老免疫细胞对肿瘤免疫微环境（TIME）的影响结果
作者首先对比了 AUCell 和 GSVA 计算 GSE115301 数据集细胞衰老评分的时间，发现 AUCell 运算速度更快（2.72 s vs 4.97 s），更适用于大规模单细胞 RNA-seq 数据；在 GSE115301 数据集中，ISENICS（AUC=0.797）的准确性略高于 TCSER（AUC=0.783）（补充图 4）。由于肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）使用共同的非小细胞肺癌（NSCLC）单细胞 RNA-seq 数据进行 TAPE 分析，因此单细胞分析包含 22 种癌症类型。作者排除中 ICSS 细胞并消除批次效应后，通过 UMAP 图展示了 78142 个细胞在 12 种免疫细胞类型中的分布，同时标注了每种癌症及细胞的主要类别（图 6A）。圆圈热图对比显示，多数癌症类型中高 ICSS 组的细胞相互作用数量和权重均高于低 ICSS 组（图 6B）；以细胞数量最多的 Mono/Macro 细胞为例，热图展示了其与其他细胞相互作用权重的变化，以及每种癌症类型中所有相互作用的总权重变化，其中结直肠癌（COAD）中免疫细胞的总相互作用权重增加最显著，膀胱癌（BLCA）中减少最显著（图 6C）。在泛癌整合免疫单细胞 RNA-seq 数据的通信分析中，热图展示了细胞相互作用权重，发现与低 ICSS 组相比，高 ICSS 组中 Mono/Macro 细胞的相互作用信号明显更多，而 CD8+T 细胞（CD8T）的相互作用信号明显更少（图 6D）；条形图显示，TNF 和 LIGHT 是免疫细胞低 ICSS 组特有的信号通路（图 6E）；气泡图展示了细胞相互作用配体 - 受体对调控的不同通信概率，表明免疫细胞衰老后，Mono/Macro 细胞 ICSS 组间配体 - 受体相互作用可能上调，CD8T 细胞 ICSS 组间可能下调（图 6F）。综上，作者在单细胞水平揭示了衰老免疫细胞对 TIME 中细胞相互作用的影响，包括相互作用数量、权重及关键信号通路的变化，为理解衰老免疫细胞如何响应信号并调节免疫应答提供了关键依据。
（六）衰老免疫细胞与免疫治疗响应的关系及预测模型构建结果
作者分析了带有响应注释的免疫治疗数据集（GSE203115、GSE145281、GSE207422），首先通过 UMAP 图展示了细胞聚类为不同亚型的结果（图 7A）；百分比条形图显示，高 ICSS 细胞的免疫治疗响应比例低于低 ICSS 细胞（图 7B）；热图及卡方检验表明，ICSS 组与免疫响应组存在显著相关性，高 ICSS 组多为非响应者（NR），低 ICSS 组多为响应者（R）（图 7C）。为构建免疫响应预测模型，作者先计算免疫细胞 ICSS 组间的 DEGs，再通过单变量 Cox 回归分析和 LASSO 回归筛选出 62 个与免疫治疗响应相关的显著基因，并对这些基因与 CellAge 基因交集的基因进行重要性评估，发现如 ETS1 等关键预测因子具有多重作用（可调节核糖体蛋白基因、延缓细胞衰老并与多种 ICP 分子表达相关）（图 7D）。作者使用这 62 个基因，基于多种机器学习算法（朴素贝叶斯、随机森林、K 近邻、AdaBoost 分类树、Boosted 逻辑回归）构建免疫治疗响应预测模型，ROC 曲线及 AUC 值显示，随机森林和 AdaBoost 算法的预测效果较好（图 7E）；对比其他与免疫治疗响应相关的临床特征（STAT1、HAVCR2、CD274、CTLA4、IFNG、CD28），该模型的 AUC 值更高（图 7F）。综上，作者证实衰老免疫细胞的富集与较差的免疫治疗响应显著相关，并成功构建了基于关键基因的免疫治疗响应预测模型，且该模型预测效果优于传统临床特征。
本研究开发了一种名为 ISENICS 的新型模型，用于量化肿瘤免疫微环境（TIME）中衰老免疫细胞的特征并探究其临床意义。研究整合了来自 TCGA、GTEx、GEO 和 TISCH 数据库的 bulk RNA-seq、单细胞 RNA-seq 及临床数据，覆盖 23 种癌症类型和超过 14000 个样本，将 TAPE 深度学习反卷积算法与 ICSS（免疫细胞衰老评分）相结合，为研究衰老免疫细胞提供了新工具。通过该模型，研究揭示了不同癌症中多种免疫细胞类型的衰老异质性，发现肿瘤样本衰老水平多低于正常样本、单核细胞 / 巨噬细胞易与其他细胞共衰老、高免疫衰老水平患者预后更佳等关键特征；在单细胞水平，证实多数癌症中衰老免疫细胞会增加细胞间相互作用的数量和强度，且含衰老免疫细胞的样本免疫治疗响应较差；同时，基于筛选的 62 个关键基因构建的免疫治疗响应预测模型，其准确性优于传统临床特征。尽管研究存在基因集选择影响模型效率、ICSS 需更多实验验证等局限性，但 ISENICS 模型仍为从系统层面理解 TIME 机制提供了可扩展的新方法，不仅有助于表征衰老免疫细胞的作用，还为解析 TIME 内复杂相互作用提供了思路。
