板块“白话单细胞”代号“Vernacular”（白话）目标是用最通俗易懂的语言，把单细胞测序相关内容给大家讲懂。
上次给大家分享的文献中使用了10x Genomics免疫组库测序（scBCR-seq），详情可见：Masterpiece｜另辟蹊径，用BCR克隆多样性识别肿瘤细胞，今天小编给大家讲讲单细胞免疫组库测序建库原理。
免疫组库测序其实主要测的就是TCR/BCR的基因序列，编码TCR/BCR的4个基因簇V(可变区)、D（高变区）、J（编码蛋白连接V、C区）、C（恒定区）会发生随机重组排列（图1），这就是TCR和BCR多样性的来源，所以免疫组库测序又称V(D)J测序。
传统免疫组库测序利用的是多重PCR或5’ RACE方法，但都存在一定的局限性，如多重PCR扩增法范围局限在CDR3区，5’ RACE 法只能获得单链全长信息等。10x Genomics单细胞V(D)J技术的到来打破了传统免疫组库测序的局限，不但可以将TCR/BCR双链完美匹配，实现成对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）的全长测序；还可以细化到单细胞水平，并同时获得表达谱信息。
下面来说说，该技术如何实现以上优点：
10x单细胞免疫组库测序利用微流控和油滴包裹技术捕获单细胞，原理与小编前面介绍的10x单细胞转录组测序的原理基本相似（详情请移步：Vernacular｜搜索单细胞测序总能看到这张图，但我还是不懂10x单细胞是怎么回事）。
01 GEMs形成
Gel Beads、Oil 和要被捕获的细胞们由通道通过微流控芯片形成一个个油包水结构，即GEMs（包含单个细胞及单个Gel Beads）。由于V(D)J 区段是在mRNA 的5'端，所以免疫组库测序所用Gel Beads小触角（Primer）的最右侧序列为TSO序列（见图2A红框）。
02 反转录形成一链
那么TSO序列是如何捕获细胞的呢？cDNA一链又是如何形成的呢？详情请看图3：
03 文库构建
当Gel Beads与细胞结合并在油包水环境中反转成cDNA后，我们对获得的全长cDNA序列进行扩增。扩增纯化后的cDNA可分为 2 份，一份通过设计在TCR或BCR的C区的巢式PCR引物，进行TCR或BCR富集后构建免疫组V(D)J文库，另一份直接用于构建5’转录组文库，从而实现在单细胞层面同时对基因转录本和免疫组库进行高通量测序的目的（图4）。
如何获取V(D)J序列全长信息
为了保证文库信息可以涵盖完整的V(D)J信息序列，我们使用巢式PCR技术将全长cDNA库中包含完整V(D)J信息的序列特异性扩增富集出来（图5）。
扩增得到的V(D)J全长序列会被随机酶切为不同长度的片段，之后末端修复、加A、加接头构建V(D)J文库（图6）。
构建好的V(D)J文库测序会获得许多条不同的reads，其中有相同UMI序列标签的reads都来自于同一条V(D)J全长序列。这些来自同一V(D)J序列的reads长度不一，我们将含有相同UMI序列的reads中的Read2序列拼接起来，就可以获得V(D)J序列的全长信息（图7）。
至此，我们通过建库，PCR扩增，上机测序等步骤，就完成了对样本中每个细胞V(D)J基因重排信息的捕捉，以便查看TCR/BCR丰度和多样性；同时还可获得每个细胞所有转录本序列信息，从而准确地分析基因表达差异、基因结构变异、筛选分子标记等生命科学重要问题。
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