文献分享（xenium 5k）--不同的滤泡性 T 细胞亚群调控淋巴瘤的进展及临床结局

作者，Evil Genius

1993年，虚岁34，我该如何写我呢。

写我20岁，鲜衣怒马，心比天高，眼里全是来日可期的万丈风光！

写我30岁，历经起落，才终于看透人各有命，世事皆是无常。

后来才懂，年少时那股一往无前的心气儿，是此生仅有，不可再生的宝藏。一旦被岁月磨平，便再也寻不回当初那个一腔孤勇、横冲直撞的模样。

到了这个年纪，接受了平凡，也释怀了无常。青春虽然换了季，但我依然是我，只是学会了在无常里，从容前行。

大家如果想要自己分析单细胞空间数据，没有基础可以参加一下2026番外--linux、R、python培训, 基础扎实 + AI辅助，应该可以hold住自己的项目分析。

空转分析已经做了多年，基本上来看，主流还是要靠visium和xenium，visium HD（也包括stereo-seq）很难顶起一篇文章。

今日我们分享文献，大量的积累xenium相关的文献，为后续分析Atera做好准备。

知识积累

滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）的特征是肿瘤性滤泡结构的扩增，研究提示其具有独特的 T 细胞免疫特征。然而，除滤泡辅助性 T 细胞（T follicular helper cells，TFH）外，滤泡内其他 T 细胞的异质性及其在 FL 中的作用仍未得到充分研究。

近期研究发现，肿瘤浸润性 T 细胞的数量与 FL 患者较低的早期复发率显著相关。

滤泡辅助性 T 细胞（T follicular helper cells，TFH）是淋巴滤泡（包括肿瘤性滤泡）中的主要 T 细胞类型，已有研究报道其在 FL 中发挥促肿瘤作用。

滤泡调节性 T 细胞（T follicular regulatory cells，TFR）被鉴定为驻留于生发中心的调节性 T 细胞（regulatory T cells，Treg），能够在生理稳态及疾病状态下调节免疫反应。

结果1、FL 中不同的滤泡 T 细胞亚群发生扩增

单细胞数据分析，不仅包含非滤泡辅助性 T 细胞（non-TFH）滤泡 T 细胞亚群，还包括滤泡调节性 T 细胞（TFR）、滤泡细胞毒性 T 细胞（TFC）以及 7 种已知的 T 细胞亚群，例如滤泡辅助性 T 细胞（TFH）、调节性 T 细胞（Treg）、细胞毒性 T 细胞（Tct）、记忆 T 细胞（Tmem）和初始 T 细胞（CD4⁺ Tnv4、CD8⁺ Tnv8）等。

差异表达基因（DEG）分析显示，TFR 细胞同时表达 TFH 和 Treg 标志基因，而 TFC 细胞则同时表达 TFH 和细胞毒性 T 细胞（Tct）标志基因，据此对这两类细胞进行了注释。

进一步对效应 T 细胞组分（包括 TFC、TFH、Treg 和 Tct 细胞）进行亚群再聚类，鉴定出以下细胞亚群：CD4⁺ TFC（TFC4）或 CD8⁺ TFC（TFC8）；效应型 TFH（TFH-eff）或静息型 TFH（TFH-rst）；效应型 Treg（Treg-eff）或静息型 Treg；以及效应型细胞毒性 T 细胞（Tct-eff）、耗竭型细胞毒性 T 细胞（Tct-exh）和静息型细胞毒性 T 细胞（Tct-rst）

除已知的效应型 TFH 细胞比例升高现象外，与 MFLN 相比，FL 中 TFR、TFC4 和 TFC8 细胞的比例均显著升高。

结果2、FL 中非 TFH 滤泡 T 细胞亚群的特征分析

进一步表征这 3 种在 FL 中扩增的细胞亚群，将其差异表达基因与 FL 中的效应 T 细胞亚群以及 MFLN 中对应的细胞亚群进行了比较。

1. TFR 细胞的转录特征

FL 中的 TFR 细胞同时高表达 Treg 细胞的特征性标志基因（FOXP3 和 IL2RA），以及典型的 TFH 相关基因。其中，后者包括与效应功能相关的基因 CXCR5 和 PDCD1，以及驱动 TFH 细胞发育的转录因子编码基因 ASCL2 和 TOX2。

还发现，FL 中的 TFR 细胞特异性上调了 IL10，以及其他在 T 细胞中功能尚不明确的基因，包括 ADGRG1、CEP128、FOXB1 和 HAL。

2. TFC4 和 TFC8 细胞的转录特征

FL 中的 TFC 细胞亚群（TFC4 和 TFC8）表达与细胞毒性功能相关的基因，例如颗粒酶家族基因 GZMK 和 GZMM。不过，与 TFC4 相比，TFC8 对部分细胞毒性相关基因的表达水平更高。

此外，FL 中的 TFC 细胞亚群还表现出多种特征性转录程序，包括：

- 干细胞样 CD8⁺ T 细胞特征：表达 PDCD1 和 TCF7。

- CXCR5⁺ CD8⁺ T 细胞特征：表达 CXCR5。

- 组织驻留记忆 T 细胞特征：表达 ITGAE。

- 中央记忆/初始 T 细胞特征：表达 CD27、CD28 和 IL7R。

与耗竭型细胞毒性 T 细胞（Tct-exh）相比，TFC 细胞亚群中典型耗竭标志基因 HAVCR2 和 LAG3 的表达较低。

此外，与效应型和耗竭型细胞毒性 T 细胞（Tct-eff 和 Tct-exh）相比，TFC 细胞亚群表现出更高的 TFH 相关趋化因子基因 CXCL13 表达，以及更低的 CXCR6 表达。

与典型的细胞毒性 CD4⁺ T 细胞不同，FL 中的 TFC4 细胞与 TFC8 细胞具有相似的转录特征：二者均高表达 BCL6——一种决定 TFH 细胞分化谱系的重要转录因子；同时低表达 PRDM1，后者可与 BCL6 形成相互调控关系。

尽管具有上述 TFH 相关特征，FL 中的 TFC 细胞亚群仍表现出较高的 CCR7 表达水平，这有助于细胞进入 T 细胞区域。

此外，与效应型 TFH 细胞相比，TFC4 细胞（以及 TFC8 细胞）中支持 B 细胞功能所必需的基因 CD40LG、ICOS 和 IL21 表达较低。

研究人员还发现，一组独特的标志基因，包括 APLP2、CAV1、HMOX1 和 VIPR2，在 FL 的 TFC 细胞亚群中呈现较高表达。

值得注意的是，与 MFLN 中对应的细胞亚群相比，FL 中非 TFH 滤泡 T 细胞亚群的许多差异表达基因仍表现出显著上调。这提示，这些细胞的表型不仅具有细胞亚群特异性，还与 FL 的病理状态密切相关。

3. 流式细胞术验证细胞亚群特征

与差异表达基因分析结果一致，研究人员利用流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析人类 FL 样本，检测到了以下细胞群：

- TFR 富集群： CD4⁺ CD127⁻ PD-1^hi CD25⁺ 细胞。

- TFC4 富集群： CD4⁺ CD25⁻ PD-1^hi Granzyme K⁺ TCF1⁺ 细胞。

- TFC8 富集群： CD8α⁺ PD-1^hi CXCR6⁻ TIM-3⁻ 细胞。

这些细胞群的关键蛋白表达模式与 scRNA-seq 差异表达基因分析结果一致。

进一步地，研究人员对从 FL 样本中分选得到的 TFR 富集细胞和 TFC8 富集细胞进行了单细胞 RNA 测序，并将其转录组数据映射至参考单细胞图谱。结果显示，TFR 富集细胞和 TFC8 富集细胞分别特异性定位于参考图谱中的 TFR 和 TFC8 细胞区域，且表现出一致的转录特征。

综上所述，FL 中的 TFR、TFC4 和 TFC8 细胞具有各自独特且多样化的基因与蛋白表达谱。这些结果提示，FL 肿瘤微环境可能赋予这些细胞亚群独特的功能特征。

结果3、跨癌种滤泡性T细胞图谱研究

研究目的与方法： 开展了泛癌分析，在滤泡性淋巴瘤（FL）背景下对比不同癌种，刻画滤泡性T细胞亚群特征。共分析26种癌症类型的30个单细胞RNA测序数据集，在计算层面提取473,446个T细胞，并与图1C所示图谱整合，最终获得包含512,570个肿瘤浸润T细胞的泛癌图谱。

主要发现：

细胞比例特征： FL中鉴定为TFH-eff和TFH-rst的细胞（占全部T细胞）比例较高；TFR细胞比例在FL中同样偏高。TFC4细胞在FL和弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）数据集中均常见，但FL中比例倾向于高于DLBCL。TFC8细胞比例在不同癌种间差异较大，但在FL和DLBCL中显著偏高。
转录组相似性： FL与DLBCL的TFC细胞亚群表现出强转录组相关性（TFC4 ρ=0.94，TFC8 ρ=0.97），并共享关键标志基因表达，这与两者发病机制部分共享相一致。参考图谱中建立的TFC8特征在所有分析癌种的TFC8细胞中均显著上调。
功能基因异质性与分群： 部分关键功能基因的表达随癌种变化。基于关键基因的层次聚类将各癌种TFC8细胞分为三组：
- 第1组： TFH特征基因（BCL6、PDCD1）、迁移相关基因（CXCR5、CCR7）和干性基因（TCF7）高表达，耗竭相关基因低表达；
- 第2组： 上述TFH/迁移/干性基因表达较低，耗竭相关基因表达较高；
- 第3组： 表达模式居中。
黑色素瘤的特殊性： 黑色素瘤TFC8细胞是唯一被归入第1组的实体瘤来源TFC8细胞。基于PDCD1和TCF7高共表达，这些细胞可能对应或包含干性样CD8 T细胞——该类细胞已被广泛报道为黑色素瘤肿瘤控制的关键贡献者，尤其通过响应免疫治疗进行增殖发挥作用。
FL/DLBCL与黑色素瘤对比： FL和DLBCL的TFC8细胞同样归入第1组，且相较黑色素瘤TFC8细胞，功能基因（如颗粒酶基因GZMK、GZMM，CXCL13、TCF7）表达更高，而HAVCR2表达更低。

结果4、FL中非TFH滤泡性T细胞亚群的空间特征

研究方法： 为绘制FL中非TFH滤泡性T细胞亚群的空间分布图谱，使用Xenium In Situ系统对12例FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）FL样本进行空间分辨单细胞转录组分析，采用预设计的5K基因面板并补充基于scRNA-seq差异表达基因数据定制的附加面板。随后，为将观察扩展至大队列并进行稳健分析，又使用PhenoCycler Fusion系统对来自三家机构的242例新诊断FL样本进行多重数字空间 profiling（MDSP），检测基于scRNA-seq DEG结果遴选的28种抗体。

主要发现：

细胞类型确认与聚类： Xenium数据确认了具有scRNA-seq所记录的TFR、TFC4、TFC8基因表达模式的单细胞存在；无监督聚类和亚聚类成功识别出非TFH滤泡性T细胞簇，其转录特征与scRNA-seq图谱一致。
空间定位特征： TFR细胞优先见于结节滤泡（NF）内部，而TFC细胞亚群优先见于NF边缘。TFR细胞到NF或恶性B细胞（B malig）的最小距离倾向于短于Treg细胞；TFC细胞亚群相较Tct细胞更靠近NF或恶性B细胞；TFR细胞又比TFC细胞亚群更靠近NF或恶性B细胞。
趋化因子信号驱动的迁移能力：
- CXCL13–CXCR5轴（促进细胞在B细胞滤泡中聚集）在三种非TFH滤泡性T细胞亚群与已知滤泡组分（TFH、恶性B细胞、FDC）之间均一致增强。
- CCL19/CCL21–CCR7轴（主要由TRC介导，引导细胞向T细胞区迁移）在TFC细胞亚群中高度激活，但在TFR细胞中不激活。
- 空间平滑密度计算显示：CXCL13密度在NF内较高，CCL19/CCL21密度在T细胞区升高；CXCL13密度在TFH细胞坐标处达峰，CCL19/CCL21密度在naive T细胞位置达峰。
- 关键发现：在非TFH T细胞群体中，TFR细胞坐标处CXCL13密度最高、CCL19/21密度最低；而代表两者空间重叠程度的CXCL13与CCL19/21联合密度在TFC细胞亚群位置最高。
MDSP大队列验证： 在发现队列（n=91）中，检测到CD3e+CD4+PD-1hiFOXP3+细胞为TFR，CD4+或CD8+ plus CD3e+颗粒酶K+PD-1hiTCF1+细胞分别为TFC4和TFC8；关键蛋白表达模式与scRNA-seq一致；空间与距离关系重现了Xenium分析结果。基于细胞间距离的空间互作分析结合层次聚类，将TFR、TFC4、TFC8、TFH和Tct-exh细胞归为具有强互作活性的滤泡性T细胞相关群体；细胞定位相关分析特别发现TFR与TFH之间、TFC4与TFC8之间存在极高相关性。
细胞邻域（niche）形成： TFR与TFH细胞形成独特的细胞邻域，提示其相互作用比一对一方式更高效；TFC4与TFC8细胞与Tct-exh细胞形成另一邻域，与其在NF边缘区域偏倚分布一致。上述发现在验证A队列（n=78）和验证B队列（n=73）中得到验证。

结论： FL的空间转录组学与MDSP揭示了由CXCL13–CXCR5和CCL19/CCL21–CCR7轴组织的滤泡性T细胞亚群独特拓扑定位与邻域形成：TFR细胞与TFH细胞共同定位于NF内部，TFC细胞亚群定位于T–B边界区域。

结果5、FL中非TFH滤泡性T细胞亚群的功能特性

研究目的： 利用人FL样本研究非TFH滤泡性T细胞亚群的功能。

主要发现：

1. 趋化迁移能力

TFR富集细胞： 对CXCL13呈现浓度依赖性迁移，但对CCL19无反应。
TFC8富集细胞： 同时向CXCL13和CCL19迁移，两种趋化因子同时存在时迁移最强。

2. TFR细胞的免疫抑制功能（间接抗淋巴瘤作用）

与FL TFR细胞中上调的Treg相关免疫抑制基因表达一致，体外共培养实验显示：在TCR刺激下，TFR富集细胞可抑制CD3+CD4+PD-1+CD25− TFH富集细胞的晚期活化（CD69−CD25+）和分裂（CellTrace Violet示踪）。
FL中恶性B细胞的活化与存活依赖TFH细胞的支持性互作。体外实验重现：与TFH富集细胞共培养时，CD19+CD10+恶性B细胞富集组的CD86+活化比例显著升高、annexin V+凋亡比例显著降低。
但加入TFR富集细胞后，TFH细胞的支持效应被抵消，证明TFR细胞通过抑制TFH细胞活性发挥间接抗淋巴瘤作用。

3. TFC4与TFC8细胞的细胞因子产生与细胞毒性

细胞因子： TFC4富集细胞产生的IFN-γ和TNF-α高于TFH或Tnv4/CD4中央记忆T细胞富集组；TFC8富集细胞产生这些细胞因子的能力也强于Tnv8/CD8中央记忆T细胞富集组。TFC8富集细胞产生的TNF-α水平甚至超过Tct-exh富集细胞，这与小鼠干性样CD8 T细胞的既往报道一致。
脱颗粒/细胞毒性： TFC4和TFC8富集细胞在PMA/离子霉素刺激下均表达CD107a，反映其脱颗粒活性，是细胞毒性潜能的标志。
直接杀伤： 与TFC8富集细胞共培养时，恶性B细胞富集组的CD86+活化比例显著低于单培养、annexin V+凋亡比例显著高于单培养。
增殖与活化潜能： 与高TCF1表达一致，TFC8富集细胞的分裂和晚期活化能力强于CD3+CD8a+PD-1hiTIM-3+ Tct-exh富集群体，表明TFC8细胞保留更高的增殖和活化潜能。

结论： FL中的非TFH滤泡性T细胞亚群通过离散的间接和/或直接机制发挥显著抗肿瘤功能，并具有增强的迁移能力。

结果6、IL-21优势诱导独特细胞表型

研究目的： 探究FL中非TFH滤泡性T细胞亚群的起源及其形成因素。

主要发现：

1. 起源与分化轨迹（scTCR-seq与RNA velocity）

FL中TFR与TFH或Treg细胞的TCR克隆型共享高于MFLN中对应细胞簇；FL中TFC4细胞主要与TFH细胞共享克隆型，而TFC8细胞仅与Tct-eff和Tct-exh细胞共享增加。
RNA velocity分析表明：TFR和TFC4细胞分别主要来源于Treg和TFH细胞；TFC8细胞部分来源于Tct-rst细胞，并分化为Tct-exh细胞。

2. 上游调控因子分析

IPA分析提出IL-21信号、TCR信号、IL-2和TGF-β1为非TFH滤泡性T细胞亚群的相关诱导因子。
FL中IL-21由TFH细胞分泌（TFH主要通过与被恶性B细胞和FDC互作而激活）。细胞互作分析显示，由TFR或TFH细胞来源IL-21介导的IL-21信号在TFR、TFC4、TFC8、TFH、Treg和Tct细胞中显著富集。
与MFLN相比，FL效应T细胞组分中IL21和IL21R上调；TFR和TFC细胞坐标处的IL21空间平滑密度显著高于其他非TFH T细胞亚群。
FL肿瘤微环境细胞（单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）中TGFB1较MFLN对应细胞上调；TGF-β已知为人类初始TFH细胞分化的关键信号。

3. 细胞诱导实验

TFR诱导： 对人FL样本CD3+CD4+PD-1dim/−CD25+ Treg富集细胞进行诱导，加入IL-21和TGF-β1后，TFH相关TFR标志物（BCL6、CXCR5、PD-1）表达显著升高。
TFC4诱导： 向TFH富集细胞加入TGF-β1可降低CD40L、增加CCR7、TCF1和颗粒酶K表达；IL-21与TGF-β1联用进一步上调CCR7和TCF1。
TFC8诱导： 向Tnv8/Tct-rst富集细胞加入IL-21和TGF-β1，显著增加TFC8标志物（CCR7、颗粒酶M、TCF1）表达并下调PRDM1。

4. 诱导后scRNA-seq验证

对不同细胞因子条件下培养的Treg、TFH、Tnv8/Tct-rst富集细胞进行scRNA-seq，发现分别表达TFR、TFC4、TFC8关键基因及IL21R的细胞簇，注释为诱导性i-TFR、i-TFC4、i-TFC8细胞。
i-TFR、i-TFC4、i-TFC8比例在含IL-21（i-TFR和i-TFC8需加TGF-β1，i-TFC4不加TGF-β1）培养时最高。
同时加入IL-21和TGF-β1时，各诱导组分中非TFH滤泡性T细胞亚群关键标志物表达和基因特征富集均增加。

结论： 富含IL-21和TGF-β的肿瘤微环境诱导FL中非TFH滤泡性T细胞亚群表型的形成。

结果7、非TFH滤泡性T细胞亚群的临床相关性

研究目的： 通过多中心回顾性研究，利用MDSP数据检验非TFH滤泡性T细胞亚群的临床相关性。

主要发现：

1. 与早期疾病进展的关系

由于TFC4与TFC8细胞占全部T细胞的比例呈强相关（ρ=0.93），分析中将两者合并为单一TFC细胞组分。
在24个月内发生疾病进展（FL中提示生存不良的重要早期临床终点）的患者，其TFR和TFC细胞比例均显著更低。

2. 生存预后价值（发现队列）

基于最大选择秩统计预测复发时间（TTR）的结果，将TFR和TFC细胞比例截断值分别设为2.0%和2.5%。
TFR比例较高（≥2.0%）或TFC比例较高（≥2.5%）的患者，TTR显著长于比例较低者。
基于TFR和TFC比例的联合分组（TFR/TFC类别）能清晰区分TTR：两者比例均高的患者TTR极佳，两者均低的患者TTR尤其短。上述发现在验证队列中得以重现。

3. 多因素分析与亚组分析

在所有队列数据的多因素分析中，FLIPI、TFH比例、TFR比例、TFC比例及TFR/TFC类别均保持预后意义，且该趋势在各队列中一致。
TFR/TFC类别在不同年龄、病理分级、治疗内容和FLIPI风险的患者亚组分析中均能区分TTR。

4. 预测模型改善

ROC曲线分析显示，在FLIPI因素基础上加入TFR和TFC细胞比例或TFR/TFC类别信息，可显著提高曲线下面积（AUC）；连续净重分类改善和综合判别改善对两者均显著。
TFR/TFC类别还可显著预测发现队列和验证A队列患者的总生存和FL相关生存。

5. 公共数据验证

利用公开bulk基因表达数据集分析显示，TFC基因特征对DLBCL及FL的总生存或无失败生存均具有显著有利的预后影响。

结论： 非TFH滤泡性T细胞亚群的定量在多个独立FL队列中具有预后意义，支持其抗肿瘤特征，并有潜力改善淋巴瘤的风险分层。