实验说明:
外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常持续几天,多用于启动子和其他调控原件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72h内分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β-半乳糖苷酶等来帮助检测。
设备耗材:
六孔板:Corning公司
1.5ml EP管:Biosharp公司
移液枪
试剂:
Lipo6000:碧云天公司,C05026
Opti-MEM:Gibco公司,31985-070
DMEM:Gibco公司,C1196500BT
转染的质粒
实验步骤:
1.NIH3T3细胞提前24h传代铺到6孔板中(每孔细胞在5x105,细胞系不同,细胞大小不同,需要查阅相关文献),控制细胞密度在80%-90%左右进行脂质体转染。
2.转染前半小时换Opti-MEM培养基。
3.Opti-MEM稀释脂质体:转染一个6孔板的一个孔为例,在无菌EP管中加入125ul的Opti-MEM培养基,加入2倍质粒量的脂质体(如2.5ug质粒,加入5ul脂质体Lipo2000/6000),混匀后室温静置5min。
4.在另一个无菌EP管中加入125ulOpti-MEM培养基稀释2.5ug质粒并混匀。
5.将步骤3和4的溶液混匀,室温孵育20min。
6.将混合溶液均匀缓慢地加入到NIH3T3细胞中,摇晃混匀。
7.6h后将培养基更换为完全培养基。
8.恒温箱37°培养。
9.一般在转染24h后可检测到表达(如GFP荧光信号),48h达到较高水平,可以此判断转染效率。
注意事项:
1.质粒浓度不能太低,否则影响转染体系,如6孔板转染,每孔质粒量约为2.5ug。
2.脂质体与质粒比一般按照2:1为最佳,过高比例会有一定的毒性。
3.96孔:0.1ug质粒 0.2-0.5ul脂质体
24孔:0.5ug质粒 1-2.5ul脂质体