StatQuest-对RNA-seq的介绍

RNA-seq的三个主要步骤

1. 建库
2. 测序
3. 数据分析

1. 建库

workflow

step1 分离RNA
step2 打断RNA

测序机器一次最多只能测200-300bp

step3 逆转录成双链cDNA

DNA比RNA更稳定，更易扩增和修饰

step4 加接头

1)让测序机器识别序列片段
2)用不同的接头同时测序不同的样品

step5 PCR扩增
step6 QC

2. 测序

• 原理：序列片段垂直的连接到“flow cell”上，测序仪通过特异性荧光探针连接到碱基，一层一层测序，每测一层拍照识别，识别后洗脱颜色继续测序。
• 质量分数的产生原因：

  1. 有些荧光探针会失效

  2. 低多样性的产生（一般发生在测序开始，机器识别序列片段位置的时候）

• 测序结果
  • @ 唯一的序列ID标识符，可选的序列描述内容，以空格分开
  • 序列信息
  • +后为空或加上@后信息
  • 碱基质量字符 可以按一定规则转换为碱基质量得分，进而反映该碱基的错误率。

• 比对参考基因组

• 过滤低质量基因reads

  
  
  正常read
  
  
  低质量read
• reads计数

• 标准化reads计数

  
  
  举例--为什么要标准化
  
  

  影响计数的原因：1.reads质量 2.reads浓度

3.数据分析

• PCA画图：1.可视化差异 2.排除异常样本
• 差异表达分析：三大R包