在分子生物学中基因调控机制的破解往往需要精准的“侦查工具”。当我们已知一个关键的蛋白（多为转录因子），却不知道哪些基因能够被转录因子调控，也就是说该蛋白能结合到哪些基因的启动子上并调控基因的表达，谁能担此“破案”重任？答案就是——酵母反向单杂技术。
对于深耕酵母实验技术服务与转化的小源来说，见证了这项技术在农林植保、作物育种等领域的无数“破案时刻”，从“超级害虫”抗性机制到水稻抗倒伏育种，从小麦抗病调控到生长-防御平衡解析，酵母反向单杂是贯穿基础研究与应用转化的核心技术。让我们先从传统的酵母单杂（Y1H）与反向单杂（TF-centered-Y1H）的区别中认识反向单杂！
小源在多年技术服务中，曾依托该技术为多家科研单位提供酵母反向单杂及相关验证等支持，助力多项成果落地。今天就通过四篇署名文献，带大家看懂酵母反向单杂如何“顺藤摸瓜”，从蛋白出发锁定DNA序列，揭开转录因子调控基因表达的神秘面纱。
文章中所用酵母反向单杂技术均由南京瑞源生物提供支持。
署名文献一：
水稻生长与防御平衡——解码植保素合成的“调控中枢”
2025年浙江省农业科学院洪高洁研究团队发表于《Plant Biotechnology Journal》发表的“OsSTK-Mediated Sakuranetin Biosynthesis and Carbon Flux Orchestrate Growth and Defence in Rice”（IF:10.5）的研究中发现水稻抗稻瘟病性与蔗糖水平呈正相关。高通量测序、KEGG等分析发现OsNOMT（Os12g0240900），其编码直接将常见中间体柚皮素转化为樱花素的柚皮素-7-O-甲基转移酶。研究通过可溶性糖钾等物质含量测定、表型以及菌生长实验证明樱花素在蔗糖介导的稻瘟病防御中具有重要作用（图1）。
图1 蔗糖促进樱花素（SAK）生物合成
A. 来自用或不用50 Suc处理的水稻芽的基因表达的差异图；B-C. A中不同表达基因的Venn（B）和KEGG（C）分析；D. 响应Suc处理的差异表达基因的RT-qPCR验证，Os 12 g 0240900是RAP-DB中OsNOMT的基因ID；E. 接种稻瘟病菌24小时的27个水稻品种的SAK含量；F-G. SAK和Suc含量之间的正相关（F）或稻瘟病菌含量和SAK含量之间的正相关（G）；H. 用或不用Suc预处理24小时的osnomt和NIP幼苗中的稻瘟病菌感染测定；I. 接种稻瘟病菌的叶片的生物量在G. Fisher最小显著差异（LSD）检验中使用。
为了研究蔗糖和樱花素之间的分子联系，Y1H筛库、双荧光素酶报告基因实验筛到并证明OsSTK与OsNOMT启动子结合，通过酵母反向单杂实验发现在OsNOMT启动子特定区域内存在三个与OsSTK潜在互作的motif（称为STKRE），随后通过EMSA、ChIP-qPCR实验验证OsSTK特异性结合OsNOMT启动子中含有STKRE的区域（图2）。
图2 OsSTK靶向OsNOMT启动子
A. OsNOMT启动子和STKRE结合位点的示意图；B. 通过Y1 H测定测试的OsSTK和OsNOMT启动子片段之间的相互作用；C. 通过瞬时转染试验检测OsSTK激活本氏烟草叶片中的OsNOMT启动子；D. 瞬时表达实验的相对LUC/REN比率。E. OsSTK可能识别的基序的分析；F. EMSA测定OsSTK与OsNOMT启动子的体外结合；G. 通过ChIP测定在OsNOMT启动子片段上的体内OsSTK富集。
小结：首次揭示 OsSTK 作为 “双重调控因子”，通过整合防御代谢与碳分配，协调水稻生长与防御的分子机制，为植物 “生长 - 防御权衡” 理论提供了新的基因层面解释。同时为水稻抗病育种提供新靶点——通过调控OsSTK的表达，可培育“高抗病性+弱生长抑制” 的水稻品种，在保障产量的同时减少农药使用，具有重要的农业应用前景。
署名文献二：
草地贪夜蛾抗Bt毒素——锁定抗性调控的“关键开关”
2023年中国农业科学院深圳农业基因组研究所萧玉涛团队发表于《PNAS》“Downregulation of a transcription factor associated with resistance to Bt toxin Vip3Aa in the invasive fall armyworm”（IF:9.1）的研究中通过RNA-Seq、RNAi以及基因编辑发现草地贪夜蛾中转录因子SfMyb的低表达降低了对Vip3Aa（Bt营养期杀虫蛋白）的易感性。其中DH-R（抗性品系）的SfMyb启动子比DH-S的具更低的活性。
通过找到出转录因子SfMyb所调控的基因能够揭示草地贪夜蛾对Vip3Aa的抗性机制。
随后研究通过酵母反向单杂揭示了共有8744个SfMyb转录因子与12个motif中的一个或多个的启动子结合。
通过对转录因子特性的考虑以及RNA测序鉴定到27个基因，它们在 DH-R 与 DH-S 之间以及用 dsMyb（降低了对 Vip3Aa 的敏感性）处理的 DH-S 幼虫与用 dsGFP（对照）处理的 DH-S 幼虫之间存在显著的表达差异。
SfMyb 能精准结合多个靶基因的启动子——这些基因可能恰好参与毒素识别和细胞应答。
表1 草地贪夜蛾中具有结合SfMyb的12个DNA基序中的每一个的启动子的数量
小结：酵母反向单杂等一系列实验鉴定出了SfMyb介导的对Vip 3Aa抗性影响的强有力的候选基因。为进一步解析草地贪夜蛾对 Vip3Aa 产生抗性的分子机制提供了重要线索。通过明确 Sfmyb 调控的下游通路，可以更全面地了解草地贪夜蛾抗性产生的分子基础，为开发新的抗虫策略和保障 Bt 抗虫作物的可持续种植提供了重要的理论支撑。
署名文献三：小麦抗叶锈病——揪出抗病性的“负调控者”
2024年河北农业大学生命科学学院王冬梅、王荣纳团队发表于《Plant Physiology》“TaCAMTA4 negatively regulates H2O2-dependent wheat leaf rust resistance by activating catalase 1 expression”（IF:6.9）的研究中,根据已有的报道TaCAMTA 4负调控小麦对Pt的抗性，经RT-qPCR、表型、亚细胞定位、酵母自激活实验等一系列实验表明TaCAMTA 4的沉默会导致Pt引起的的局部H2O2积累，且TaCAMTA 4定位于细胞核并表现出转录激活活性。
通过酵母反向单杂筛选以及单杂验证了TaCAMTA 4可以与4个motif互作。随后经基因组分析找到启动子含有这4个motif的基因，经过转录组测序、RT-qPCR等最终推测TaCAT 1是由TaCAMTA 4直接激活的靶基因（图6）。
图6 TaCAMTA 4与4个DNA基序结合，并调节启动子中具有基序的基因的表达
A. 在酵母单杂交试验中，TaCAMTA 4与4个DNA基序结合；B. 表达簇显示为在其启动子中具有motif 1、motif2、motif3和motif4的基因的热图；D. TaCAMTA 4对10个目的基因表达影响的调控分析。
TaCAMTA 4通过保守结构域CG-1结合TaCAT 1的启动子并激活其表达（Prasad et al., 2023），研究通过EMSA、RT-qPCR、ChIP-qPCR等实验证明了TaCAMTA 4能够结合TaCAT 1的启动子并激活TaCAT 1的转录（图7）。
图7 TaCAMTA 4调节的基因TaCAT 1作为小麦对Pt的防御反应的负调控因子。
A. TaCAT 1 mRNA的示意图；B. TaCAT 1在VIGS实验中的沉默效应；D. （C）中具有H2O2的细胞的面积定量；E. TaCAT 1对小麦免疫的调节；F. （E）中Pt菌丝体面积的定量；G）在13 dpi时用Pt对TaCAT 1沉默的叶的表型。
小结：研究主要证明了TaGAMTA4通过直接结合TaCAT1启动子并激活其表达，加速H₂O₂分解，从而负调控小麦对叶锈病的抗性。酵母反向单杂的结果揭示了TaCAMTA 4作为一种已知转录因子的新的识别序列特征，为Ca 2+-CaM-CAMTA模块调控植物免疫的分子机制提供了重要的支持，并为鉴定Pt的潜在毒力效应子奠定了理论基础，同时为解析小麦抗病调控网络提供了关键的分子证据。
署名文献四：
水稻次生细胞壁发育——找到细胞壁合成的“指挥者”
2022年中国科学院遗传与发育生物学研究所张治国团队发表于《Frontiers in Plant Science》“RLM1, Encoding an R2R3 MYB Transcription Factor, Regulates the Development of Secondary Cell Wall in Rice”（IF:4.8）的研究中发现编码R2R3型MYB转录因子的基因RLM1是调控水稻次生细胞壁形成的关键“开关”。
研究发现与拟南芥同源性对比以及酵母测定法对RLM1的反式激活分析发现RLM 1具有转录激活活性。通过转录组分析和RT-qPCR验证rlm 1-D植物中有19个参与类苯丙酸代谢途径的基因上调。但编码R2 R3 MYB转录因子的RLM 1的功能尚不清楚。
为确定由 RLM1 直接调控的靶点位点，利用酵母反向单杂发现RLM 1能够结合以MYB1AT为核心顺式作用元件的20个motif，且它们都在苯丙素代谢途径上调基因的启动子中。结合转录组分析发现，研究选取表达量较高的关于水稻木质素合成的OsCAD 2（Ookawa et al.，2014）作为接下来的研究对象（图3，4）。
图4 野生型（WT）和 rlm1 -D 中苯丙素代谢途径相关基因的表达水平
A. 在抽穗后期，通过 qRT-PCR 方法测定了野生型（WT）和 rlm1 -D 植株中与苯丙素代谢途径相关的基因的表达水平（样本数量为 3 个）；B. 对野生型（WT）和 rlm1 -D 中的 OsCAD2 进行表达分析；C. 对野生型（WT）和 rlm1 -D 中的 OsCCR1 进行表达分析。
研究通过酵母单杂、EMSA、双荧光素酶报告基因等实验证明RLM 1与OsCAD 2启动子的结合并激活OsCAD 2（图5）。
为了阐明RLM 1的调控网络，研究通过酵母文库筛选等实验发现RLM 1被OsMAPK 10磷酸化，磷酸化的RLM 1可能激活下游靶基因的表达。
图5 RLM 1与OsCAD 2的基序结合并激活其表达
A. MYB 1AT基序盒位于OsCAD 2起始密码子上游约1931 -1938 bp处；B. 使用Y1 H测定来测试RLM 1与MYB 1AT基序的结合；C. DNA-蛋白质结合试验显示RLM 1与OsCAD 2启动子中的MYB 1AT基序结合；D. EMSA显示GST-RLM 1重组蛋白直接与OsCAD 2启动子片段的生物素标记探针结合；E. RLM 1诱导proOsCAD 2::LUC信号传导，在水稻原生质体中检测到LUC活性。
小结：通过以酵母反向单杂为核心的实验揭示了MAPK-MYB-OsCAD 2的调控网络，完善了R2R3 MYB转录因子调控植物细胞壁合成的分子机制。为水稻抗倒伏、茎秆品质改良提供了精准靶基因——通过调控RLM1表达优化次生细胞壁结构，有望培育高产抗逆的水稻新品种，为塑造理想株型、提高水稻产量提供了理论意义和实用价值。
酵母反向单杂的“核心价值”
从害虫抗性到作物发育，再到抗病机制，酵母反向单杂是连接“DNA序列”与“调控蛋白”的核心桥梁。它的优势显而易见：
✔精准性：直接验证蛋白与DNA的体外结合关系；
✔高效性：可快速从motif文库中筛选未知DNA，缩短研究周期；
✔普适性：适用于动物、植物等不同研究对象，应用场景广泛。
下次再看到“某转录因子调控某基因”的研究时，不妨留意一下——酵母反向单杂或许就是那个“幕后功臣”哦！
我们实验目的只要是想找到蛋白互作的潜在DNA靶标，不仅有酵母反向单杂实验，还有染色质免疫沉淀（ChIP），那么二者有什么区别？我们应该如何选择？我们可以从下列表格的对比中进行区分。
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参考文献
[1] Hu J ,Li L ,Zhao Y , et al.OsSTK-Mediated Sakuranetin Biosynthesis and Carbon Flux Orchestrate Growth and Defence in Rice.[J].Plant biotechnology journal,2025,DOI:10.1111/PBI.70358.
[2] Minghui J ,Yinxue S ,Yan P , et al.Downregulation of a transcription factor associated with resistance to Bt toxin Vip3Aa in the invasive fall armyworm.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2023,120(44):e2306932120-e2306932120.DOI:10.1073/PNAS.2306932120.
[3] Zhenhua C ,Shouzhen T ,Di L , et al.RLM1, Encoding an R2R3 MYB Transcription Factor, Regulates the Development of Secondary Cell Wall in Rice [J].Frontiers in Plant Science,2022,13905111-905111.DOI:10.3389/FPLS.2022.905111.
[4] Sun T ,Ma N ,Jiao Y , et al.TaCAMTA4 negatively regulates H2O2-dependent wheat leaf rust resistance by activating catalase 1 expression.[J].Plant physiology,2024,DOI:10.1093/PLPHYS/KIAE443.
