再次体验一下TBtools的强大。使用TBtools对基因家族进行分析，进化树、Motifs 、结构域和基因结构多图合一。
一、数据准备
1.基因组组装结果fasta格式
2.基因组注释结果gff3格式
3.模式物种或近缘物种的基因家族的蛋白序列fasta格式
二、软件
1.TBtools （https://github.com/CJ-Chen/TBtools）
2. MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)
3.Batch CD-Search （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）
4.MEGA (https://megasoftware.net/)
三、实战操作
示例选用了P450基因家族进行分析。
1.下载已知物种的基因家族蛋白序列
在数据库中下载了意大利蜂的Cytochrome P450 9e2基因家族序列的蛋白序列。
2.提取目标物种蛋白序列
TBtools中GXF Sequences Extract插件输入目标物种gff文件和基因组fa文件，设置输出cds.fa
TBtools中 Batch Translate CDS to Protein 将提取到的核酸序列翻译成氨基酸序列。
得到蛋白质序列
3.多序列比对
TBtools中 Blast Several Sequnences to a Big Database, 输入意大利峰P450蛋白序列，和提取到目标物种的蛋白序列。设置E值等。
输出结果
复制比对上的gene名，下一步根据这些gene名提取目标物种的P450蛋白序列。
4.提取目标物种的P450基因家族所有蛋白序列
TBtools中Fasta Extract，输入目标物种所以蛋白fasta文件和P450基因名，设置输出结果。
得到目标物种的P450基因家族的序列就完成了很重要的一步，接下来可以进行基因家族分析。
5.基因家族Motif分析
首先打开MEME网页进行在线分析，设置输入P450基因家族蛋白序列点击提交。
上传数据后会自动识别为Protein，可以设置希望发现的motif数量，这里设置为10，最后点击提交。
在输出结果中点击MAST XML output下载。接下来在TBtools中进行可视化。
设置输入文件mast.xml，可视化结果如下。
6.基因家族保守结构域分析
首先打开NCBI的Batch CDD 网页进行在线分析，设置输入P450基因家族蛋白序列点击提交。
下载结果文件，为txt格式，可以根据需要选择。之后在TBtools中可视化。
在设置输入下载的txt文件和P450蛋白序列文件，点击开始得到以上结果。
7.基因结构分析
TBtools中 Visualize Gene Structure完成, 基因组注释gff文件和P450基因名。[图片上传失败...(image-ca7bc4-1690456092704)]
得到基因结构的结果。
8.基因家族进化分析
接下来通过MEGA构建一个简单的基因树，输入数据为目标物种P450基因家族的蛋白质序列。
先进行多序列比对，用MUSCLE默认参数。
将比对好的结果保存为.meg格式。
重新打开比对后的文件，构建进化树，使用最大似然法，根据需要选择建树方法。再构建之前可以进行模型的预测，这里节省时间直接使用默认参数。
现在就构建好了一棵进化树，导出为.nwk格式。接下来最后一步就是再TBtools中展示所有结果。
9.展示所有结果
TBtools中 Gene Structure View （Advanced）, 共输入4个文件，从上到下，第一个进化树的.nwk格式文件，第二个MEME结果文件.xml格式，第三个基因组注释文件。gff格式，第四个Batch-CDD结果文件（这个需要手动修改，第一列基因名，第二列，起始位置，第三列终止位置，第四列蛋白质结构域）。
这样基因家族进行分析，进化树、Motifs 、结构域和基因结构的一张图就画好了。
总的来说TBtools进行基因家族分析还是非常方便的，图形界面的操作用文字描述有些不便学习操作，大家可以参考陈老师b站中的教学视频CJchen-0410。
以上内容仅为个人总结，如有错误之处敬请批评！
