Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis

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background

现有的研究发现，circRNA的表达在不同物种间是高度保守和表达丰富的。circRNA可作为miRNA sponging调控下游基因表达，可以与蛋白结合参与转录调控等。所有这些研究的一个共同点就是，circRNAs以RNA的形式行使功能。而在本研究中，研究人员通过肌肉分化过程中的circRNA鉴定，发现了调控肌生成的circRNA，该circRNA在这个过程中是可以翻译蛋白参与调控。

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result

1. 肌生成相关保守circRNA鉴定

为探究与肌生成特异性相关的circRNA，研究人员对人正常组织，DEM组织和小鼠正常组织的成肌细胞（GM）和培养分化为肌小管的细胞（DM）进行了高通量二代测序。通过3个大类的差异比较组合分析发现，在小鼠和人中共有超过3000个差异基因出现。当把肌小管相比成肌细胞上调的基因进行GO分析，发现肌肉分化和功能的相关基因显著富集。

其中在人中发现的2100多个circRNA和小鼠中发现的1600多个circRNA间，共有600多个同时在两个物种中表达。当对DMD病人来源的RNA测序数据分析，也发现病人相比正常人的成肌细胞与肌小管中都存在着大量异常表达的circRNA。

此外，研究人员还对来源于相同基因的circRNA和线性RNA之间的表达相关性进行了研究，发现存在表达正相关，且上调基因的差异比较显著。

2. CircRNAs功能筛选

为进一步的后续功能研究，研究人员通过4个原则对circRNA进行了筛选，共筛选出31个circRNA，筛选原则见下：

（1）小鼠和人都保守；（2）表达水平；（3）分化过程中有调控作用；（4）circRNA与linear RNA的ration。

通过后续的RT-PCR验证和确认，筛选出20个circRNA，研究人员对这20个circRNAs进行了siRNAs干扰。进一步的脱嗅氧尿苷（BrdU）标记实验显示发现，敲除circ-ANF609后，成肌细胞增殖加快。在DMD病人中的检测也表明，circ-ANF609表达升高。因此，circ-ZNF609通过调控细胞增殖影响肌生成。

3. Circ-ZNF609可编码蛋白

Circ-ZNF609是由ZNF609的第二个外显子成环而来，进一步的结构元件研究发现：这个区域有753-nt的开放阅读框（ORF）。核糖体结合蔗糖梯度实验结果显示，circ-ZNF609有多聚核糖体结合位点（IRES）。且在小鼠中也得到了相应的验证。

通过构建过表达载体（P-circ, P-circ3XF），发现circ-ZNF609可编码两个蛋白。线性ANF609的过表达实验也表明，线性ANF609能产生和circZNF609一样的两个蛋白，且表达丰度高于circ-ZNF609。因此，circRNA的蛋白翻译能力低于cap-dependent的线性RNA翻译。

为进一步确认从基因组来源的circ-ZNF609的蛋白编码能力，研究人员运用CRISPR/Cas9系统在小鼠胚胎干细胞中插入3XFLAG编码序列（只针对第二个外显子）。通过RT-PCR验证，蛋白质谱鉴定，研究人员发现能检测到circ-ZNF609编码的多肽序列。此外，通过热激胁迫，circ-ZNF609的翻译能力会增强。

因此，通过以上实验，研究人员发现circZNF609能翻译蛋白，且受热激胁迫诱导。

4. IRES激活circ-ZNF609 UTR

进化分析显示，circ-ZNF609的5’UTR区域与线性ZNF609的UTR序列高度保守。为验证该区域示范有IRES-like活性，研究人员在荧光素和水母荧光之间插入circ-ZNF609 UTR。实验表明，UTR区的特定序列是IRES激活的必要条件，且是剪切依赖模式。

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conclusion

circRNA能翻译蛋白的必要条件：

（1）序列上含有开放阅读框（ORF）

（2）能与多核糖体结合

（3）能检测到翻译的蛋白产物

（4）含有翻译激活原件