shRNA：小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA，shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6启动子确保shRNA总是表达；shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。
本文有以下几节构成：
1.shRNA设计总原则
2.目的序列的获取
3.shRNA设计的引物序列
4.载体合成
一.shRNA设计原则：
1.克隆到shRNA表达载体 中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。
2.两个互补的寡核苷酸 两端须带有限制性酶切位点。
3.Stratagene发现29个寡核苷酸 较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。
4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录 的发生。
5.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。
6.ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，有报道认为5'TCAAGA3'序列最为有效(AMBION use)，但是也需要根据载体情况而定，最常用的还是CTCAGA。
7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)。
8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。
9.从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。
二.靶点序列的选择
方法一：sigma网站直接获取
Sigma公司做了一个针对人和小鼠的shRNA库，而且部分基因的shRNA序列经过验证，因此直接使用Sigma公司已验证过的RNAi序列最为方便。
点开网站，https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh
输入基因名AFAP1-AS1，
发现sigma网站上并没有合适的sh序列，只有si，没有已经验证过的sh序列，因此可以换另一种方法。本基因并没有找到，如果有已经验证过的序列，则直接把序列搬家即可。
方法二：Life Technologies网站
打开网站Invitrogen Block-iT RNAi Designer (thermofisher.com)，在shRNA框内输入accession number或者Nucleotide sequence，这两个信息可以在NCBI网站查到。NCBI中的每一条基因序列都有一个accession number，是数据库接受这条序列的时候给的，是一个唯一的编，就像人的身份证号码一样。
在NCBI→gene→输入AFAP1-AS1，AFAP1-AS1 AFAP1 antisense RNA 1 [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI (nih.gov)，往下拉，找到它的accession为NR_026892.1
，将此编号输入框内，下拉点击RNAi design
即可得到不同的target sequence。
选取原则：1.避免选取GGG和CCC等高GC序列 ；2.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。根据Rank评星，从中选取合适靶点序列（一般选择3~5条，不同位置各一条）。
选择完成后，点击Design shRNA Oligos：
然后在“Default Loop Sequence”选择合适的序列，在“Custom Loop Sequence”处输入合适的loop环序列，点击Design，即得shRNA序列。
sh的序列应包括：
Forward:酶切位点1+目的序列+CTCGAG（loop环）+目的序列反向重复序列+TTTTT（终止转录）
Reverse:酶切位点2+目的序列+CTCGAG（loop环）+目的序列反向重复序列
目前总结到的常见loop环序列：
CTCGAG，TTCAAGAGA，5'TCAAGAG3'序列
需注意：如果要构建到慢病毒载体上，合成出去的shRNA引物会根据载体有些不一样，本组用的载体是pLKO.1载体，根据师姐的经验，选用CTCGAG序列，点击design。
三.引物订购
pLKO.1载体的U6启动子可以保证RNA高效转录，但是酶切位点比较单一，仅有AgeI和EcoRI
shRNA序列一般为：
Forward oligo:
5’ CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG 3’
Reverse oligo:
5’ AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense 3’
①CCGG和AATT是酶切位点的残端，AgeI，EcoRI。
②TTTTT（一般是5~6个T）是为了终止转录
因此，只要根据life Technologies网站的结果，换一下linker就可以。针对上述life Technologies网站中得到的sense—CTCGAG—antisense 序列，进行以下检查：1.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T，这可能导致shRNA转录的提前终止。2.尽量不要选择GC含量高的序列，使得引物不易变性成单链，影响实验结果。
Forward1:
5'- CCGGGCACACGGCTTATAATTAATCCTCGAGGATTAATTATAAGCCGTGTGCTTTTTG -3'
Reverse1:
5’ -AATTCAAAAAGCACACGGCTTATAATTAATCCTCGAGGATTAATTATAAGCCGTGTGC-3'
Forward2:
5'-CCGGGCTTCCTTCTCTACGTCTTCACTCGAGTGAAGACGTAGAGAAGGAAGCTTTTTG-3'
Reverse2:
5’- AATTCAAAAAGCTTCCTTCTCTACGTCTTCACTCGAGTGAAGACGTAGAGAAGGAAGC-3'
Fordward3:
5'-CCGGGCAATTCACTGAGTGGTTACGCTCGAGCGTAACCACTCAGTGAATTGCTTTTTG-3'
Reverse3:
5’- AATTCAAAAAGCAATTCACTGAGTGGTTACGCTCGAGCGTAACCACTCAGTGAATTGC-3'
Fordward4:
5'-CCGGGGTAGAGGATAATGCCTATGCCTCGAGGCATAGGCATTATCCTCTACCTTTTTG-3'
Reverse4:
5’- AATTCAAAAAGGTAGAGGATAATGCCTATGCCTCGAGGCATAGGCATTATCCTCTACC-3'
Fordward5:
5'-CCGGGCAAGACATCCGATGGTATACCTCGAGGTATACCATCGGATGTCTTGCTTTTTG-3'
Reverse5:
5’- AATTCAAAAAGCAAGACATCCGATGGTATACCTCGAGGTATACCATCGGATGTCTTGC-3'
此外需要对RNA序列进行验证，
验证1：以DNAMAN验证RNA二级结构
以F1为例，sequence→secondnary structure→current可以得到如下的结果
验证2：分析引物是否匹配
打开snapgene软件，以第一对引物为例，新建DNA序列，输入正向引物的序列F1。而后点击“引物→添加引物”，将R1作为引物序列输入，可得到
四.载体构建
使用上述引物，将RNA扩成cDNA后进行DNA连接，一个以pLKO.1为骨架的慢病毒载体就构建好了。具体步骤可见shRNA慢病毒载体合成步骤 - 简书。
