壹、高保真酶扩增目的片段

启动子等：用Genome DNA模板扩增
CDS等：用cDNA模板扩增

PS:根据实验在设计引物时在5端和3端添加相应的酶切位点及其保护碱基

贰、目的片段和对应载体双酶切

DNA（50 μL）:

DNA product---------------20 μL
10X Buffer------------------5 μL
Restriction enzyme I-----1.5 μL
Restriction enzyme II----1.5 μL
灭菌水-----------------------22 μL

载体（50 μL）:

质粒------------------------10 μL
10X Buffer------------------5 μL
Restriction enzyme I-----1.5 μL
Restriction enzyme II----1.5 μL
灭菌水-----------------------32μL

叁、双酶切的目的片段和对应载体T4连接

体系（10 μL）

DNA---------------7.7 μL
质粒-----------------0.3 μL
T4 DNA ligase---1 μL
10X T4 buffer----1 μL

连接时间： 16℃/室温 2 h

肆、转化、涂板、挑单克隆验证、阳性菌落测序

伍、序列截断、质粒修复、去除酶切位点

设计相应的截断引物、修复引物、点突变引物
高保真酶扩增整个质粒（18 cycles）
DpnI消化正常质粒 (2 μL DpnI; 5 μL 10X buffer; --37℃ 1h); 胶回收（Y/N均可）
转化（优选5 μL）、挑单克隆验证、阳性菌落测序

OTHER

高保真酶PCR后，TA克隆加A：

纯化产物-------------20 μL
10XTaq Buffer--------3 μL
Taq enzyme ----------1 μL
dNTP-------------------5 μL
灭菌水------------------1μL

Note:一般定点突变后的氨基酸的密码子遵循在人类中表达概率最高[密码子优化表]

[ other ] 同源重组法分子克隆

方法：含有载体同源片段的PCR产物 + 线性化的质粒载体

目的DNA片段：5’端加入14-26bp与载体切口两端相同的碱基序列（如HindIII 酶切位点和>14bp载体序列，这样可以确保重组方向）
载体：线性化（限制性内切酶单酶切割）
位点选择：无重复序列且GC含量适中

Note: 偷懒法可以直接用PCR产物直接重组

如何避免形成菌落星斑

氨苄青霉素抗性基因通过产生β-内酰胺酶分解抗生素，保护细菌。长时间培养时，细菌会分泌出大量的β-内酰胺酶破坏培养基中氨苄青霉素，导致不含质粒的空菌落生长成菌落星斑。缩短培养时间可以避免产生菌落星斑。