大家好，今天要和大家分享的是2021年8月发表的一篇章：“Weighted gene co-expression network analysis reveals that CXCL10, IRF7, MX1, RSAD2, and STAT1 are related to the chronic stage of spinal cord injury”。在本项研究中，作者利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)阐明与脊髓损伤(SCI)相关的特定模块和中枢基因。首先，作者从GEO数据库下载基因表达谱GSE45006和GSE2599，通过WGCNA分析识别共表达网络模块。随后通过构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和维恩图来识别枢纽基因。定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)验证候选基因在脊髓损伤与正常样品中的表达。最后，作者分析了中枢基因和免疫浸润细胞的相关性。研究共确定了14402个基因和7个模块。棕色模块的5个枢纽基因（CXCL10、IRF7、MX1、RSAD2和STAT1）表达存在显著差异，可能是脊髓损伤的潜在诊断和预后标志物。
发表杂志：AnnTransl Med.
影响因子：3.931
该文章从投稿到接收不到两个月，属于非肿瘤分析经典的蹭热点思路（与免疫浸润结合）。而在生信分析部分，其实还有很多内容可以补充提高。
研究背景
作为中枢神经系统的重要组成部分，脊髓损伤(SCI)是导致残疾的常见原因。严重的脊髓损伤伴有上下通路传导障碍。根据最新统计，SCI影响全球超过2704万人。身体损伤导致受伤脊髓出血、肿胀、缺血、缺氧、神经元和神经胶质细胞坏死。随着脊髓水肿和炎症的发展，神经元和神经胶质细胞的坏死和凋亡扩散到损伤中心以外的组织。胶质疤痕的形成可以稳定继发性损伤的扩散，也可以阻止轴突的再生。炎症反应、水肿、缺血、缺氧、兴奋性毒性、自由基损伤、脂质过氧化、细胞凋亡、胶质瘢痕形成等继发性损伤都严重影响神经的可塑性和功能恢复。
流程图
分析解读：
数据收集
①从GEO数据库下载基因表达谱GSE45006用于WGCNA共表达网络构建。
②从GEO数据库下载基因表达谱GSE2599用于后续模型验证。
结果：归一化处理后，GSE45006数据集箱线图的中线处于同一水平。
筛选模块基因
①提取前5000个差异表达基因的表达矩阵，作为网络构建的输入数据。根据无标度网络规则选择加权系数β。
结果：软阈值功率下的拓扑网络分析。
下图A：软阈值功率函数的无标度拟合指数。
下图B：软阈值功率函数的连通性。
WGCNA
①确定加权系数β后，将差异基因的表达矩阵转化为基因间的邻接矩阵、拓扑矩阵和相异矩阵。
②基于TOM，通过层次聚类方法进行基因聚类，通过动态切割算法进行系统聚类树的模块识别。
③当特征基因的相关系数平方>0.9、软阈值功率为18、基因数在100以上、切割高度等于0.95时，得到7个不同的共表达模块并用不同颜色表示。
结果：构建了7个共表达模块并以不同颜色显示。
下图：基因网络的热图。
下图：模块特征关联。每行对应一个模块性状基因，每列对应一个性状。
下图：棕色模块基因与脊髓损伤阶段基因之间的散点图。
富集分析
①使用Metascape数据库对特定模块中的基因进行注释和可视化，进行基因本体论(GO)分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析。
结果：
下图A-C：GO富集分析。(A)生物过程。(B)细胞成分。(C)分子功能。
下图D：KEGG富集分析。
功能模块关键基因鉴定
①利用String网站构建PPI网络。
②使用Cytoscape软件进行可视化。
③维恩图分析GSE2599和GSE45006之间的中枢基因。
④qRT-PCR验证大鼠SCI样本和大鼠正常脊髓样本的3对慢性期中的5个候选基因。
结果：
下图：棕色模块的PPI网络。圆圈代表模块中的枢纽基因，线条表示枢纽基因之间的相互作用。不同的颜色代表不同的聚类基因。较粗的线代表较高的连接强度。
下图：GSE2599和GSE45006之间中枢基因的维恩图分析。
下图：基于PPI网络的5个关键候选基因的表达水平。
下图：qRT-PCR验证。
枢纽基因与免疫浸润的相关性分析
①分析中枢基因和免疫浸润细胞的相关性，并将结果可视化。
②构建疾病模型，通过流式细胞术分析检测免疫浸润细胞的数量。
结果：
下图：枢纽基因与浸润免疫细胞的相关性分析。CXCL10(A)、IRF7(B)、MX1(C)、RSAD2(D)、STAT1(E)和浸润细胞。
下图：流式细胞分析：脊髓损伤大鼠的CD4 T细胞和CD19 B细胞均显着增加。
小结：
在本项研究中，作者利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与脊髓损伤(SCI)相关的特定模块和关键调控基因。同时，利用生物信息学方法对基因模块和关键基因进行功能注释和功能分析，并对结果进行验证。研究发现棕色模块被认为是SCI阶段最关键的模块。棕色模块的CXCL10、IRF7、MX1、RSAD2和STAT1五个枢纽基因之间存在显著差异，可能是SCI的潜在诊断和预后标志物。另外，免疫细胞浸润也可能在SCI的慢性阶段发挥了重要作用。
