Background knowledge
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，其主要细胞类型为血液中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（T细胞、B细胞），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
以抽10mL血为例：
一、物品准备
① 15mL离心管 ×3，50mL离心管 ×2
② 抗凝抽血管
③ 吸管
④ 1640全培
二、步骤
照台30min期间抽血即可
① 抽血10mL（注意无菌，找熟练的护士，过来人告诫 切莫找实习生！）
② 在 50mL离心管 中 等量PBS混匀（10mL全血 + 10mL PBS混匀）
③ 在2支 15mL离心管中，（先加后加均可，保持明显分层即可，习惯上先加Ficoll）
首先加入 5mL Ficoll分离液
然后倾斜离心管，沿管壁缓慢加入 10mL②中稀释的全血，务必轻柔缓慢，使Ficoll和血液明显分层
④ 离心
1,800rpm，30min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。
离心前后分层情况如下图所示，白膜层即PBMC
⑤ 吸取白膜层（抽血不易，尽量吸完，上下多吸点无碍）至 15mL离心管（可用中枪头套小枪头吸取）
⑥ 加入PBS 洗2遍，300g 5min（悬浮细胞正常离心参数）
⑦ 1640重悬培养 或 冻存液重悬冻存
三、PBMC激活
【1】包被法（需预先包被）
① 六孔板 CD3 5μg/mL 800μL（室温2h 或 4℃过夜）
② 加入 4.5M(x 10^6) PBMC + 3mL 1640全培 + CD28 1μg/mL + IL-2 100U/mL 刺激2~3d【待确认】
【2】可溶性抗体激活（激活效能依赖细胞密度，太稀不能激活）
【待补充】
【参考资料】
LLL师姐、GZQ师兄笔记
