问题
如何将单细胞数据导入 R？
不同类型的数据/信息（例如细胞信息、基因信息等）是如何存储和操作的？
如何获得细胞和基因的基本汇总指标并相应地过滤数据？
如何直观地探索这些指标？
学习目标：
了解单细胞数据如何存储在BioconductorSingleCellExperiment对象中。
从处理后的scRNA-seq count数据创建一个SingleCellExperiment对象。
访问SingleCellExperiment对象的不同部分，例如rowData、colData和analysis。
从矩阵中获取几个汇总指标，以汇总跨细胞或基因的信息。
通过构建逻辑向量并使用[运算符对对象进行子集化，将基本过滤器应用于数据。
直接从存储在SingleCellExperiment对象中的数据生成基本的数据可视化。
在本章中，我们将开始对分析中使用到的核心包进行实际介绍。
我们将使用芝加哥大学Yoav Gilad实验室中来自三个不同个体（Tung et al. 2017）的诱导多能干细胞数据集。实验在Fluidigm C1平台上进行，使用唯一分子标识符（UMI）进行定量。数据文件位于工作目录中的data/tung文件夹中。原始文件位于GEO中GSE77288（GSE77288_molecules-raw-single-per-sample.txt.gz）。
注意：
这些数据缺少以下几点：
稀疏矩阵。由于使用的是tung数据集，因此我们只得到一个常规矩阵。如果我们决定使用10x数据集，那么引入它可能会更容易。
rowData - 没有包含任何基因注释，尽管也可以轻松地包含它，例如有关哪些基因是核基因或线粒体基因的信息。
4.1 scRNA-seq分析软件包
有几种软件包（或软件“生态”）可用于单细胞分析。在本课程中，我们将重点介绍Bioconductor项目中的一组软件包。
Bioconductor是专为生物分析开发的R软件包库。它拥有一系列出色的scRNA-seq分析软件包，这些软件包在《使用Bioconductor进行单细胞分析》一书中进行了总结。Bioconductor的优点在于它对包提交有严格的要求，包括在每个平台上的安装以及带有教程的完整文档，解释如何使用该包。Bioconductor还鼓励使用标准数据结构/类和编码风格/命名约定，以便理论上可以将包和分析组合成大型流程或工作流。具体来说，对于scRNA-seq，使用的标准数据对象称为SingleCellExperiment，我们将在本节中详细了解它。
Seurat是另一个流行的R软件包，它使用自己的数据对象Seurat。Seurat软件包包含大量函数和出色的文档。由于其受欢迎程度，如今其他几个软件包也与Seurat对象兼容。虽然这不是本课程的重点，但我们有一个部分说明了使用此包的分析工作流程：使用Seurat分析scRNA-seq。
Scanpy是一个流行的scRNA-seq分析的python包，它将数据存储在名为AnnData的对象中。与Seurat和Bioconductor类似，开发人员可以为与AnnData包兼容的主包编写扩展，从而允许社区扩展其功能。
虽然我们主要关注Bioconductor包，但我们将在本课程中学习的概念适用于其他替代方案，主要变化的是所使用的确切语法。
4.2 SingleCellExperiment对象
表达数据通常存储在定量后的特征x细胞表达矩阵中。在scRNA-seq分析中，我们通常从count矩阵开始分析，代表每个细胞中特征的read/UMI的数量，特征可以是基因、异构体或外显子等。通常，分析是在基因层面进行的，这也是我们在本课程中将重点关注的。
除了定量矩阵之外，还可能有每个基因的信息（例如它们的基因组位置、它们属于哪种基因、它们的长度等）以及细胞的信息（例如，其来源组织、患者捐赠者、处理批次、疾病状况、治疗暴露等）。
我们还可以根据原始count数据生成其他矩阵，例如标准化count矩阵。最后，由于单细胞实验数据维度非常高，我们经常采用降维技术来捕捉较低维度数据中的主要变化。
SingleCellExperiment（简称SCE）是一个以同步方式存储所有这些信息的对象。可以通过特殊函数访问该对象的不同部分：
- 可以通过
assay或assays函数来访问一个或多个表达矩阵。 - 可以使用
rowData函数获取有关基因的信息。 - 可以通过
colData函数访问有关细胞的信息。
其中一些数据存储在具有相似名称的插槽中，可以通过@运算符访问，但使用访问器函数被认为是一种更好的编程风格。
4.2.1 创建SCE对象
测试数据下载地址：https://singlecellcourse.cog.sanger.ac.uk/index.html?shared=data/
首先，根据数据创建一个SingleCellExperiment对象。data/tung中有两个文件：
-
counts.txt—— 一个制表符分隔的文本文件，包含每个基因/细胞的基因计数。 -
annotation.txt—— 带有细胞注释的制表符分隔的文本文件。
使用read.table()函数将它们读入R：
> tung_counts <- read.table("data/tung/molecules.txt", sep = "\t")
> tung_annotation <- read.table("data/tung/annotation.txt", sep = "\t", header = TRUE)
现在可以使用同名函数创建一个SingleCellExperiment对象：
> library(SingleCellExperiment)
> tung <- SingleCellExperiment(
assays = list(counts = as.matrix(tung_counts)),
colData = tung_annotation
)
> rm(tung_counts, tung_annotation)
如果我们打印该对象的内容，我们将得到一些有用的信息：<
> tung
class: SingleCellExperiment
dim: 19027 864
metadata(0):
assays(1): counts
rownames(19027): ENSG00000237683 ENSG00000187634 ... ERCC-00170
ERCC-00171
rowData names(0):
colnames(864): NA19098.r1.A01 NA19098.r1.A02 ... NA19239.r3.H11
NA19239.r3.H12
colData names(5): individual replicate well batch sample_id
reducedDimNames(0):
altExpNames(0):
- 共有19027个基因（行）和864个细胞（列）。
- 有一个名为“counts”的assay。
- 提供了一些基因名称（“rownames”）和细胞名称（“colnames”）的预览。
- 没有基因元数据（“rowData”为空）。
- 可以看到细胞的一些元数据（“colData”）。
要访问SCE对象的不同部分，可以使用以下访问器函数：
命名Assay
我们可以随意给assay取名。不过，需要遵循一些惯例：
counts：原始计数数据，例如特定基因的read数或转录本数。normcounts：与原始计数具有相同尺度的标准化值。例如，counts除以以1为中心的细胞特定尺度因子。logcounts：对数转换计数或类似计数的值。在大多数情况下，定义为对数转换的normcounts，例如使用以2为底的对数和伪计数1。cpm：每百万计数。这是每个细胞中每个基因的read数，除以每个细胞的文库大小（以百万为单位）。tpm：每百万转录本数。这是每个细胞中每个基因的转录本数除以该细胞中的转录本总数（以百万为单位）。每个assay都有一个函数访问，可以使用
counts()函数访问“counts” assay。以下两个操作是等效的：counts(tung) assay(tung, "counts")
如上所创建的SingleCellExperiment对象适用于任何场景，只要我们有一个可以读取到文件中的计数矩阵。当然，要读取常用工具cellranger（用于处理10x Chromium数据）的输出，DropletUtils包中有一个专用函数，它简化了导入数据的过程。以下是示例用法：<
> library(DropletUtils)
> sce <- read10xCounts("data/pbmc_1k_raw")
> sce <- read10xCounts("data/pbmc_1k_filtered")
4.2.2 修改SCE对象
要修改SCE对象的某些部分，我们可以使用<-赋值运算符，以及我们想要修改的对象的部分。例如，要创建一个新的assay：assay(sce, "name_of_new_assay") <- new_matrix。下表总结了其他用例。
举个例子，对计数数据进行一个简单的转换，即取以2为底的对数并加上伪计数1（否则 log(0) = -Inf）：
> assay(tung, "logcounts") <- log2(counts(tung) + 1)
因为我们将assay命名为“logcounts”，这是常规的名称之一，所以我们可以使用专用函数来访问它：
> logcounts(tung)[1:10, 1:4]
NA19098.r1.A01 NA19098.r1.A02 NA19098.r1.A03 NA19098.r1.A04
ENSG00000237683 0.000000 0.000000 0.000000 1
ENSG00000187634 0.000000 0.000000 0.000000 0
ENSG00000188976 2.000000 2.807355 1.000000 2
ENSG00000187961 0.000000 0.000000 0.000000 0
ENSG00000187583 0.000000 0.000000 0.000000 0
ENSG00000187642 0.000000 0.000000 0.000000 0
ENSG00000188290 0.000000 0.000000 0.000000 0
ENSG00000187608 1.000000 3.000000 0.000000 2
ENSG00000188157 1.584963 2.000000 1.584963 2
ENSG00000237330 0.000000 0.000000 0.000000 0
以下是修改SCE对象中数据的其他方法的总结：
往期内容：
重生之我在剑桥大学学习单细胞RNA-seq分析——3. 单细胞分析中的R/Bioconductor简介（1）
重生之我在剑桥大学学习单细胞RNA-seq分析——3. 单细胞分析中的R/Bioconductor简介（2）
重生之我在剑桥大学学习单细胞RNA-seq分析——3. 单细胞分析中的R/Bioconductor简介（3）
重生之我在剑桥大学学习单细胞RNA-seq分析——3. 单细胞分析中的R/Bioconductor简介（4）
