一、重组蛋白与融合蛋白

1. 重组蛋白

• 要明白什么是重组蛋白，首先要知道什么是重组DNA技术。重组DNA技术又称为基因工程或分子克隆，是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，将重组后的DNA分子引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。典型的DNA重组实验通常包含：分、切、接、转、筛五个步骤。重组DNA分子在宿主细胞中表达出的蛋白质即为重组蛋白。

2. 融合蛋白

• 融合蛋白是指通过重组DNA技术将你要表达的目的蛋白基因同表达载体上融合蛋白基因相连，这样表达出的蛋白质就会是同时具有目的基因蛋白和融合基因蛋白两个部分的重组蛋白。
• 融合蛋白与重组蛋白不是一个层次上对立的概念，融合蛋白表达只是重组蛋白表达的一种策略，融合表达是一种方法。因为融合表达具有表达效率高、产物稳定而且水溶性好、易于鉴定和纯化等优点，现已被广泛采用。融合蛋白又称标签（Tag），常用的His、GST等。

二、 HIS标签

1. 定义

6xHis标签，也称为多组氨酸标签（polyhistidine ），His6标签或hexa组氨酸标签，这是一种在转染的细胞中目标蛋白的C端或N端上由至少6个组氨酸残基链接上所组成的氨基酸序列。

2. 特点

• His标签是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸HHHHHH， 其特点是分子量小，基本不改变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性。
• 更重要的是它使蛋白质的纯化变得极为方便，根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白，即将含有目的蛋白的裂解液通过固定的二价金属离子（通常是二价Ni离子）填料，带有6his标签的蛋白质即与填料结合，其它蛋白不与填料结合，最后再用高浓度的咪唑即可将目的蛋白洗脱下来。
• His标签单抗可以用来鉴定His标签的蛋白质的表达情况（如目的蛋白的相对表达量、分子量）、在细胞中的定位以及其它特性。

3. His标签的用途

亲和纯化蛋白

• 原理：

6xHis标签通常在重组蛋白的纯化中使用，这是因为组氨酸残基的序列可以在特定的缓冲液条件下结合到几种类型固定的离子上（比如镍，钴和铜），从而达到容易检测和纯化His标签蛋白的目的。

IAMC一种非常有效的分离技术，它利用组氨酸能够与金属离子发生亲和作用的原理对蛋白质加以分离。

• 方法：

IMAC，全称是 immobilized metal-affinity chromatography，即固定金属亲和层析法。(亲和是指采用抗原-抗体之间的特异性结合来分离出自己的目标抗原或抗体）

• 金属离子的选择

镍，钴，铜是进行纯化His标签蛋白首选的被广泛使用的离子，由于它们在水溶液中对于组氨酸和半胱氨酸良好的亲和性。

镍-在这三个离子中，镍是最广泛使用的金属离子，它呈现出最高的亲和性和选择性对于His标签蛋白。然而，它也会非特异性的结合包含组氨酸群的内源蛋白。

钴-而钴提供最特异性的结合和组氨酸标签因此当纯度是首要选择时钴是二价阳离子的首选。

铜-铜离子和镍钴离子相比和His标签蛋白的结合非常强劲，但是它的特异性在三种离子中是最弱的。由于这个原因，当纯度不是最主要的目的时铜离子IMAC被使用。

• 细胞总蛋白裂解

在制备样品时，通过酶解法或机械条件细胞被裂解。因为多组氨酸标签在生理PH值和离子强度下很好的结合到IMAC树脂上。结合在几乎中性缓冲液的条件下完成。

• 漂洗

大部分科研人员使用包含10-25mM咪唑的TBS溶液作为结合/漂洗缓冲液来防止带有组氨酸残基内源蛋白的非特异性的结合.
被捕获的组氨酸标签蛋白的洗脱和回复通常使用增加的咪唑浓度(至少200mM)来实现，低PH值或一个过量的强螯合剂比如EDTA。

鉴定目标蛋白

• 跑蛋白胶：抗多组氨酸标签抗体或通过SDS-PAGE来检测靶蛋白。

• 显色：酶联免疫吸附测称ELISA,采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物发生颜色反应对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。

参考

• 【求助】 重组蛋白与融合蛋白有什么区别吗？ - 免疫学讨论版 - 专业医生社区，医学、药学、生命科学、科研学术交流 https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/4997453
• 常见蛋白标签-6xHis标签 - 简书 https://www.jianshu.com/p/6c1201cab98b
• 常见的融合蛋白表达标签——总结 - 简书 https://www.jianshu.com/p/0e9e7c941cf0