1.前言
干扰素最初作为一种抑制病毒在细胞内复制的分泌型因子被发现，根据细胞膜受体以及胞内信号转导通路的不同, 干扰素可主要分为3类, 即Ⅰ型干扰素、Ⅱ型干扰素和Ⅲ型干扰素。在正常的免疫应答中, Ⅰ型干扰素在抗病毒免疫方面有着十分关键的作用。同时干扰素作为细胞外信号分子, 在固有性免疫系统和适应性免疫系统的调控与沟通上有着重要作用。单核细胞在自身免疫病和肿瘤等疾病中发挥重要的作用。ATAC-seq技术是近年来较为热门的用于研究染色质开放性的表观遗传学技术，ATAC-seq技术利用经改造的超敏Tn5转座酶容易接近并切割开放染色质的特性, 结合高通量测序技术即可获得染色质上开放区域的位置和DNA序列信息。本研究运用ATAC-seq等技术鉴定Ⅰ型干扰素信号通路活化后人单核细胞染色质开放性改变, 在染色质层面探索单核细胞对Ⅰ型干扰素信号的响应, 为理解干扰素通路下游效应及其相关调控机制提供新的思路。
2.材料方法
2.1研究对象
健康成人的外周静脉血样本来自1名年轻女性志愿者的捐赠。
2.2方法
2.2.1 流式细胞术分选人外周血单核细胞
2.2.2 细胞培养和处理：实验组加入刺激剂IFNα, 使IFNα在培养体系中的终浓度为1 000 U/mL, 另一组加入PBS作为对照。每种处理做2个技术重复, 处理时间为2 h。
2.2.3 质控与测序：使用Illumina HiSeq X10高通量测序平台进行测序。完成测序后使用生物信息学工具分析和判断测序及文库质量。
2.3.4生物信息学分析：使用FastQC软件进行测序质量的评估。通cutadapt软件去除测序接头序列, 使用bowtiw2软件将测序得到的片段比对到人参考基因组hg19, 使用SAMtools和Picard过滤数据, 使用MACS2软件对测序数据进行统计学分析。使用综合基因查看进行可视化分析, 使用Cytoscape软件进行富集网络分析, 使用Homer进行motif分析。
3.结果
3.1鉴定受到Ⅰ型干扰素调控的染色质区域
将测序原始数据进行清理和质控后, 使用MACS2软件对数据进行处理, 找到有意义的ATAC-seq信号构成的峰。绘制MA-plot图并展示在IFNα刺激2 h后开放程度发生了改变的染色质区域 (图1) 。ATAC-seq信号显著增强的区域即染色质开放性增加的区域有430个, 相关的基因有412个;而ATAC-seq信号显著减弱的区域即染色质开放性降低的区域则有442个, 包含422个基因。
3.2ATAC-seq信号在顺式调控元件上的分布
统计这些染色质开放性发生改变的区域在人单核细胞中全基因组上的分布情况, 以及ATAC-seq信号形成的峰处于基因组上不同顺式调控元件 (CRE) 区域上的比例。发现大部分开放结构位于启动子及其临近区域, 其次是基因间区域以及基因的内含子区域。从图2中可观察到在加入IFNα刺激后, 处于启动子区域的峰在总体中所占比例有所下降, 而在基因间和内含子区域的峰的比例有一定程度的增加。
3.3 开放区域所关联基因的富集分析
筛选P值小于0.05、变化倍数大于1.5倍的ATAC-seq信号增强的区域, 对这些区域进行基因注释, 并利用DAVID进行GO分析，发现这些开放性明显增加的区域所关联的基因涉及的生物学过程大多是与干扰素相关的信号通路和抗病毒反应 (图3)
接着使用Cytoscape软件以及ClueGO插件对这些基因进行了富集网络分析（图4）。发现这些基因包括很多Ⅰ型干扰素诱导表达的基因, 例如三角形四肽重复序列的干扰素诱导蛋白基因家族的IFIT1、IFIT2以及IFIT3, 2'-5'-寡腺苷酸合成酶和OAS2, 黏病毒耐受蛋白 (MX dynamin like GTPase, 基因家族的OAS1MX) 基因家族的MX1和MX2等。
3.4 可视化分析
运用IGV软件, 对上述基因的相应区域进行了可视化分析 (图5) 。可以看到经过IFNα处理之后, 这些基因启动子以及转录起始位点区域附近的ATAC-seq信号明显增强, 染色质开放性增加。
3.5Motif分析
Motif指的是具有一定特征的模式序列, 可以与特定的结构相结合。进一步使用Homer软件对这些开放区域的具体DNA序列进行motif分析, 发现大部分motif是干扰素相关的反应元件, 如ISRE以及IRF等重要转录因子的结合位点 (图6) 。
结论
在全基因组水平上研究染色质开放性的变化, 我们发现人单核细胞在干扰素刺激早期, 细胞核内的染色质构象即发生迅速改变, 使干扰素信号通路下游基因相关CRE区域的开放性增加, 并且使DNA链上一些含有ISRE和IRF相关的结合元件暴露出来, 易于接触并结合转录因子及辅因子。我们推断, 人单核细胞受干扰素刺激后所产生的下游效应与染色质开放程度的改变有着密不可分的关系。通过调控染色质的结构以及CRE的反应性可能对干扰素的一系列下游效应产生影响。
