摘要
已有报道用特定的因子(OCT4、SOX2、C-MYC和KLF4)从不同的人原代细胞中诱导出多能干细胞。近几十年来，人成纤维细胞被广泛用作重编程研究的细胞来源。最初的IPSC生成方法使用需要将病毒DNA整合到靶细胞中的逆转录病毒或慢病毒载体。在IPSCs中可以检测到编码转录因子(OCT4、SOX2、cMYC和KLF4)的外源基因的整合，这引起了人们对突变和肿瘤形成风险的担忧。因此，理想的干细胞治疗需要使用非整合性基因传递系统，如仙台病毒、重组蛋白、合成的mRNA和游离质粒来产生无整合的IPSCs。几个研究小组已经报道，游离质粒能够将人成纤维细胞重新编程为IPSCs。虽然载体浓度和细胞密度在外体载体重编程方法中很重要，但该方法在人成纤维细胞中的优化尚未见报道。在这项研究中，我们通过使用不同浓度的游离型/附加型质粒载体(OCT4/P53、SOX2/KLF4、L-MYC/Lin28a)和不同的平板细胞密度，确定了从人成纤维细胞中产生无整合IPSCs的最佳条件。我们发现，优化的载体浓度和细胞密度加速了重编程，并提高了IPSC的生成。我们的研究提供了一种详细的循序渐进的方案，用于通过转染游离质粒来改进从人成纤维细胞中产生无整合的IPSCs。
背景
使用逆转录病毒或慢病毒载体表达重编程因子（OCT4、SOX2、KLF4 和 C-MYC）诱导多能性在各种人类细胞类型中是成功的，包括成纤维细胞、尿源性细胞和外周血细胞（Takahashi 等人 2007 ；Staerk 等人 2010 年；Zhou 等人 2011 年）。最初，使用了基于病毒的方法，这些方法高效、直接、可靠且易于采用。然而，这些方法需要整合到宿主基因组中的病毒载体，这可能导致基因突变和肿瘤形成，从而限制了此类细胞在治疗应用中的使用。为了避免这些问题，已经开发了几种方法来生成无整合诱导多能干细胞 (iPSC)，例如 piggyBac 系统、小环载体、合成 mRNA、仙台病毒、重组蛋白和游离型质粒载体 (Fusaki 等人 2009；Kim 等人 2009；Woltjen 等人 2009；Yu 等人 2009；Jia 等人 2010；Okita 等人 2011）。
在无整合方法中，游离型质粒方法是一种技术上简单、快速、方便且可重复的生成 iPSC 的方法。然而，与病毒载体相比，游离型载体的重编程效率较低（Okita et al 2010; Zhou and Zeng 2013）。此外，在许多使用游离型系统的研究中，转录因子是通过核转染单独传递的。然而，由于核转染载体摄取的差异，每个细胞的基因表达水平是高度可变的（Drozd et al 2015）。
在这项研究中，我们使用逐步协议优化了人类包皮成纤维细胞（BJ 细胞）重编程为附加型 iPSC（Epi-iPSC），该协议使用优化的载体浓度和细胞接种密度。我们相信本研究中描述的结果可用于涉及 Epi-iPSCs 生成的其他实验。
材料和方法
细胞培养
BJ 细胞从 ATCC 获得并在小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 培养基中培养，该培养基由补充有 10% 胎牛血清 (FBS; Corning)、0.1 mM 非必需氨基酸的 Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM; Welgene) (NEAA; Gibco) 和 1% 青霉素/链霉素 (P/S; Welgene)。将人类胚胎干细胞 (hESCs) 和 iPSCs 接种到涂有 Matrigel (Corning) 的培养皿上，并在 mTeSR 培养基 (Stemcell Technology) 中培养。游离型载体
游离型载体 pCLXE-hOCT4/p53、pCLXE-hSOX2/KLF4、pCLXE-hL-MYC/LIN28A 最初由 (Okita et al 2011) 描述，并从 Addgene (Cat 27078、Cat 27080 和猫 27077，分别）。转染率分析
Amaxa 4D-Nucleofector 试剂盒针对 P2 原代细胞溶液 (Lonza) 的优化用于根据制造商的说明用 pmaxGFP 对照载体 (Lonza) 转染 BJ 细胞。对于每次转染，1.5 × 106 个细胞在室温下以 13,000 rpm 的速度离心 4 分钟，然后重新悬浮在 82 µl 的 P2 原代细胞溶液和 18 µl 补充剂 1 中。混合 pmaxGFP 对照载体（0–21 µg）与 BJ 细胞的细胞悬液，并转移到 Nucleocuvette Vessel 中。使用带有 4D-Nucleofector (Lonza) 的程序设置 DT-130 转染 BJ 细胞，铺在涂有基质胶的 6 孔培养皿上，并在 MEF 培养基中培养以监测 4 周内的 GFP 表达。流式细胞术分析
GFP 阳性细胞用 0.25% 胰蛋白酶 (Gibco) 解离，用 Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (HyClone; DPBS) 洗涤，并用 DPBS 重悬。使用 BD Accuri C6 流式细胞仪 (BD Biosciences) 进行荧光激活细胞分选 (FACS) 分析 4 周。使用 FlowJo 软件 9.1 版（Tree Star）分析 FACS 数据。用于产生 iPSC 的游离型载体浓度优化
BJ 细胞 (1.5 × 106) 通过用 0.25% 胰蛋白酶处理分离，并根据制造商的说明，使用用于 P2 原代细胞溶液的 Amaxa 4D-Nucleofector 试剂盒用 pmaxGFP 对照载体电穿孔。将三种游离型载体（0-21 μg）中的每一种与 82 μl P2 原代细胞溶液和 18 μl 补充剂 1 混合。将转染的 BJ 细胞接种到 MEF 培养基中涂有基质胶的 6 孔培养皿上。转染 2 天后，去除 MEF 培养基并用 TeSR-E7 培养基（干细胞技术）替换。每天更换培养基。在转染后 10-14 天内，Epi-iPSCs 扩大到适合转移的大小。在转移之前，将 10 µMY-27632 (Selleckchem) 添加到 mTeSR 培养基中。使用 10 µl 移液器吸头将菌落转移到涂有基质胶的 4 孔培养皿上。为生成 iPSC 优化初始铺板细胞数
为了生成 Epi-iPSC，根据制造商的说明，使用用于 P2 原代细胞溶液的 Amaxa 4D-Nucleofector 试剂盒转染 1.5 × 106 BJ 细胞。游离型载体（各 3 μg：OCT4/p53、SOX2/KLF4、L-MYC/LIN28A）与 82 µl P2 原代细胞溶液和 18 µl 补充 1 混合。将 BJ 细胞和游离型载体的混合物转移到一个 Nucleocuvette Vessel 并以 DT-130 作为程序名称进行电穿孔。将转染的 BJ 细胞（每个载体总共 9 µg）接种到涂有基质胶的 6 孔培养皿（1.0 × 104、2.0 × 104、3.0 × 104、4.0 × 104、5.0 × 104、1.0 × 105、2.0 × 105 和3.0 × 105 个细胞）在 MEF 培养基中。转染 2 天后，去除 MEF 培养基并用 TeSR-E7 培养基代替。每天更换培养基。在转染后 10-14 天内，Epi-iPSCs 扩大到适合转移的大小。转移前，将 10 µMY-27632 添加到 mTeSR 培养基中。使用 10 µl 移液器吸头将菌落转移到涂有基质胶的 4 孔培养皿上。RT-PCR 和定量
PCR 根据制造商的说明，使用 RNeasy Kit (Qiagen) 分离总 RNA。根据制造商的说明，使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒 (Applied Biosystems) 将总 RNA (1 µg) 逆转录为 cDNA。根据制造商的说明，使用 Ex Taq 聚合酶 (TaKaRa) 进行 RT-PCR。在 LightCycler 1536 实时 PCR 系统 (Roche) 上使用 TaqMan PCR Master Mix (Thermo Scientific) 和 SYBR Green (Enzynomics) 进行 ANIMAL CELLS AND SYSTEMS 133 定量 PCR (qPCR)。所有值均标准化为内源性 GAPDH 对照。碱性磷酸酶染色和免疫细胞化学
根据制造商的说明，使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒（Stemgent）进行碱性磷酸酶染色。对于免疫细胞化学，用 DPBS 洗涤细胞并在室温下在 4% 多聚甲醛中固定 15 分钟。固定的细胞在室温下用 DPBS 中的 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 透化 10 分钟，然后用 DPBS 中的 2% 稀释的牛血清白蛋白 (Sigma-Aldrich) 封闭。然后将细胞在初级抗体溶液中于 4°C 孵育过夜。用 DPBS 洗涤后，将细胞在二抗中室温孵育 1 小时。基因组 DNA 分离和亚硫酸氢盐测序
为了确定 Epi-iPSC 的 DNA 甲基化状态，使用 G-spin 总 DNA 提取试剂盒 (iNtRON) 分离基因组 DNA。根据制造商的说明，使用 EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) 修饰基因组 DNA (1 µg)。通过PCR扩增人OCT4基因的启动子区域。使用 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) 纯化扩增产物并亚克隆到 TA 克隆载体 (Invitrogen) 中。使用 M13 正向引物对单个克隆进行测序。使用 QUMA（甲基化分析量化工具；http://quma.cdb.riken.jp/）对数据进行可视化和对齐。Epi-iPSCs 的分化
通过将 EpiiPSCs 铺板到 60 mm2 细菌级培养皿中来产生胚胎体 (EBs)。由大约 2.0 × 106 个细胞组成的 EB 在 mTeSR 培养基中。5 天后，将 EB 转移到新的 60 mm2 细菌级培养皿中，并在 MEF 培养基中悬浮培养 14 天。为了分化为内胚层，将 EB 接种到内胚层分化培养基中涂有基质胶的 4 孔培养皿上，该培养基由补充有 2% FBS、100 ng/µl 激活素 A (PeproTech)、1% L-谷氨酰胺 (Gibco) 的 RPMI 1640 (Gibco) 组成) 和 1% P/S，为期 3 周。为了分化成外胚层，将 EB 接种到外胚层分化培养基中涂有基质胶的 4 孔培养皿上，该培养基由 DMEM/F12（康宁）和 1 ml N-2 补充剂、10 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子（PeproTech）组成， 2 µM SB431524 (Tocris)、100 ng/µl Noggin (PeproTech)、1% L-谷氨酰胺和 1% P/S，持续 3 周。为了分化成中胚层，将 EB 接种到涂有基质胶的 4 孔培养皿中，该培养基由补充有 20% FBS、100 µM 抗坏血酸（Sigma-Aldrich）、1% NEAA、1% L-的 KnockOut DMEM (Gibco) 组成。谷氨酰胺和 1% P/S 3 周。游离体拷贝数测定
转染后，将BJ细胞培养指定天数（BJ细胞-D5、Epi-iPSCs（P1）、Epi-iPSCs（P15）、BJ细胞），并提取基因组DNA。为了确定每个细胞的载体拷贝数，使用连续稀释的载体和基因组 DNA 来生成标准曲线。每个 Epi-iPSCs 样品中 EBNA-1 和 FBXO15 的拷贝数是使用 qPCR 和质粒特异性引物从观察到的阈值循环 (Ct) 值确定的。全转录表达阵列
根据制造商的说明，使用 RNeasy 柱 (Qiagen) 从 hESC、Epi-iPSC 和阴性对照 BJ 细胞制备总 RNA 样品。Affymetrix Whole-Transcript Expression Array 处理是根据制造商的方案使用 GeneChip Whole Transcript PLUS 试剂盒进行的。如制造商所述，使用 GeneChip WT (Whole Transcript) 扩增试剂盒合成 cDNA。然后使用 GeneChip WT 末端标记试剂盒将有义 cDNA 片段化并用 TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）标记生物素。大约 5.5 μg 标记的 DNA 靶标在 45°C 下与 Affymetrix GeneChip Human 2.0 ST Array 杂交 16 小时。杂交阵列在 GeneChip Fluidics Station 450 上洗涤和染色，并在 GCS3000 扫描仪 (Affymetrix) 上扫描。使用 Affymetrix GeneChip 命令控制台软件 (AGCC) 在 Affymetrix 数据提取协议中自动提取原始数据。畸胎瘤形成
Epi-iPSCs (2.0 × 106) 与含有 Matrigel 的 mTeSR 混合并皮下注射到免疫缺陷小鼠的背外侧。注射后 8 周，解剖肿瘤并在 4% 多聚甲醛中固定。将石蜡包埋的组织切片并用苏木精和伊红 (Sigma-Aldrich) 染色。
结果
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人成纤维细胞中 GFP 质粒转染的优化
为了优化用于转染的载体量，我们用不同数量的编码 GFP 的游离型载体转染 1.0 × 105 BJ 细胞，并在荧光显微镜下监测 4 周内的 GFP 表达。图1）。对于转染率的定量分析，我们使用流式细胞仪分析了 GFP 表达。我们发现，当用最低量的载体 (3 µg) 转染细胞时，转染后 1 周 GFP 在 16.4% 的细胞中表达。 GFP 阳性细胞的数量呈剂量依赖性增加；在用最高量的载体 (21 µg) 转染的 86.4% 的细胞中检测到 GFP 表达。我们的结果表明，增加附加型载体的数量可以改善转染效率（图 1）。然而，我们发现细胞死亡的发生也以剂量依赖性方式增加（数据未显示）。因此，选择 21 μg 作为优化 iPSC 生成的三个附加型载体的最大量。
用于人成纤维细胞重编程的每种载体的剂量优化
我们优化了使用游离型载体转染 BJ 细胞的方法（图 2(A)）。 2 周后，我们观察到第一个 Epi-iPSC 簇，显示出典型的 iPSC 样形态，我们计算了转染不同量质粒（0-21 µg；图）的细胞形成的碱性磷酸酶阳性菌落板数2(B))。我们发现，与其他载体量相比，使用三种载体的混合物（每个载体 3 µg；总共 9 µg）显着提高了重编程效率（图 2(C)）。然后，我们从每组中挑选 iPSC 样菌落，并在 mTeSR 培养基中扩增 EpiiPSCs 20 代（数据未显示）。
用 0 或 3 µg 游离型载体转染的 BJ 细胞没有显示出 iPSC 样菌落，表明这两种浓度不足以在这种情况下诱导重编程。我们进一步研究了用于 BJ 细胞重编程的附加型载体的最佳浓度。虽然 9 µg 的转染效率最高，但增加到 12-21 µg 会显着降低重编程效率（约 50%；图 2(C)）。
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Epi-iPSCs 的表征
我们检查了 iPSC 样菌落是否具有 hESCs 的典型形态、分子和功能特性。 RT-PCR 分析显示 iPSC 样细胞中激活典型的多能性基因（OCT4、SOX2、NANOG、REX1、DPPA2 和 DPPA4）（图 3(A)）。为了以高分辨率评估 Epi-iPSC 的重编程状态，我们使用微阵列分析了它们的全局基因表达谱。热图分析表明，Epi-iPSCs 与 hESCs 紧密聚集在一起，但与 BJ 细胞明显分离。具体而言，与 BJ 细胞相比，已知参与多能性的基因如 OCT4、SOX2、NANOG 和 LIN28A 在 Epi-iPSC 和 hESC 中均上调。相反，与 BJ 细胞相比，通常在成纤维细胞中表达的基因，如 COL3A1、DKK1 和 IL1R1，在 Epi-iPSC 和 hESC 中均被下调（图 3（B））。流式细胞仪分析显示，Epi-iPSCs 与 hESCs 聚集在一起，但与 BJ 细胞明显不同（图 3(C)）。我们还检查了蛋白质水平上多能性的诱导。通过免疫染色确定，多能性标记 OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1-60 和 TRA1-81 在 Epi-iPSC 和 hESC 中均表达（图 3(D)）。我们检查了多能性标记 OCT4 的 DNA 甲基化状态。值得注意的是，OCT4 的启动子区域在 Epi-iPSC 中未甲基化，与对照 hESC 中的水平相似（图 3（E））。最后，我们评估了Epi-iPSCs 通过在体外诱导其分化为内胚层、外胚层和中胚层的分化能力。 RT-PCR 证实了三个胚层标记基因在 Epi-iPSCs 和分化细胞中的表达。 GAPDH 用作阳性对照 (图 3(F))。免疫细胞化学分析证实 Epi-iPSCs 表达内胚层标志物 AFP、中胚层 NKX2.5 和外胚层 MAP2（图 3(G)）。为了研究 Epi-iPSCs 的体内分化能力，我们将它们皮下移植到 NOD/SCID 小鼠中。 8 周后，我们观察到包含三个胚层、内胚层、中胚层和外胚层组织的畸胎瘤形成（图 3（H））
- Epi-iPSC 生成的细胞密度依赖性重编程
在 iPSC 生成过程中通常出现的另一个技术障碍是用于转染的电穿孔引起的细胞死亡。为了克服由细胞死亡引起的重编程失败，我们从以不同细胞密度铺板并用 3 μg 每种载体转染的 BJ 细胞生成 Epi-iPSC。在转染后约 2 周观察到最初的 Epi-iPSC 簇（数据未显示）。 6 孔培养皿中每孔 1.0 × 105 个细胞的密度对于生成 EpiiPSC 最有效（图 4）。总之，我们的数据表明，为了实现高效的 BJ 细胞重编程，编码 OCT4/P53、SOX2/KLF4 和 L-MYC/LIN28A 的三种附加型载体的最佳浓度为 3 µg，细胞密度为1.0 × 105。
