MTT溶液:称取100mgMTT粉末加入20mlPBS(高压过的),搅拌30min,使之充分溶解,过滤除菌,分装放-20℃ 避光保存即可。
其他细胞要记得每2天换液!
- 设计孔板,四周36孔用无菌的PBS填充。第一数列为调零孔,第二数列位对照孔,之后为不同浓度的加药孔。
四周用200ul PBS铺板
调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜,不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后以空白调零)
对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
加药孔(细胞、不同浓度的药物、培养液、MTT、二甲基亚砜) - 收集对数期细胞,计数,调整细胞悬液浓度,每孔1000个(对于增殖能力强的细胞;增殖能力低的多放)均匀铺于96孔板中。
垂直缓慢加入细胞 - 5%CO2,37℃孵育16~24小时(细胞贴壁后即可)。
- 铺板后 第二天选择某一固定时间取出一块96孔板,每孔加20ul MTT溶液(之前已经配置好),37°孵箱继续培养4h。
- 4h后,会看到培养液变成蓝紫色结晶(甲瓒),终止培养,用针管吸去孔内的溶液。(避光!!!!)
- 每孔再加150ul DMSO,在摇床上低速振荡10min,在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
上机器:设置 震板---->10min---->MTT 490nm - 以后每隔24h取出一块96孔板重复4~6
测4~5天的