1 需要解决的问题
最近从别的老师那里拿到了拟南芥的突变体种子，突变体的名称是SAIL_244_D02，这是一个T-DNA插入导致拟南芥基因CBF3沉默的突变体种子。因为大实验室中拟南芥的种子非常多，存在弄混的可能且需要鉴定种子是杂合体还是纯合体。所以在做后续的实验之前，必须要对突变体种子进行鉴定。对于T-DNA插入型突变体的鉴定可以通过三引物法来实现。
2 三引物法鉴定突变体的原理
2.1 关于Ti质粒和T-DNA
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
2.2 关于三引物法
PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。
经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。
因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。T-DNA本身的长度约为17kb，插入之后会阻抑两端引物的扩增产物的形成。WT为野生型植株，HZ为杂合突变体植株，HM为纯合突变体植株。
野生型WT：LP+RP（大片段）
杂合突变体HZ：LP+RP（大片段）、BP+RP（小片段）
纯合突变体HM：BP+RP（小片段）
注意SALK系列突变体用LBb1.3, SAIL系列突变体用LB3，至于为什么，参考“T-DNA Primer Design ”这个网站的说明，这个网站后面会用到。
PS: 因为我的种子是SAIL系列，所以BP用的是LB3，因为我顺着图片下方的链接下载了 [SAIL pCSA110 & pDAP101 T-DNAs]这个文件，发现文件中说了“We did all of our sequencing with LB3”，然后恰好我们实验室的引物库里有LB3，简直皆大欢喜（笑）~
但是我不知道LB1,2,3 的差别在哪里，因为这个说明中的 SAIL lines 我没搞懂是什么，也不知道“We did all of our sequencing with LB3”是指什么。有知道的师兄师姐麻烦告诉我一下哈~
3 实操设计LP和RP
解决BP的问题后，开始设计LP和RP。首先直接进入T-DNA Primer Design “http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html”这个网站，然后拉到下面，在对话框里输入突变体的名称就可以了。
我直接输入了“SAIL_244_D02”，然后点Submit。然后就会出来LP和RP，以及product size。我的Safari网站弹出来的结果是一长串的，不好截图，就没放全部啦~
这里是最简单的一键设计LP和RP的方法，下方我引用的参考资料第一篇来自知乎的帖子还列出了手动设计引物的方法，因为我也没搞懂，这里就暂时不写了，需要的可以自行查阅。
4 PCR扩增和跑胶
最后是将获得的拟南芥突变体种子种出叶片，提取DNA，分别用LP + RP和 BP + RP 进行PCR扩增。（我没有直接把三个引物同加在一个管子里，而是分别用LP + RP和 BP + RP 进行PCR扩增了两次。所以每个个体有左右平行两个跑胶结果。）
图中标出的WT是 wildtype 野生型（LP+RP只扩出了大片段， BP + RP没有扩增出来），col-1是杂合体（LP+RP扩出了大片段， BP + RP扩出了小片段），cbf-1 和cbf-2是纯合体（LP+RP没有扩出大片段， BP + RP只扩出了小片段）。
Over~完事！
参考资料：
1 知乎：三引物法鉴定T-DNA插入突变体
https://zhuanlan.zhihu.com/p/377200556
2 LP RP 引物设计网站： T-DNA Primer Design
http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html
3 简书： 拟南芥突变体信息查询
https://www.jianshu.com/p/db695e0756ba
