title：The Mammalian Spermatogenesis Single-Cell Transcriptome, from Spermatogonial Stem Cells to Spermatids

journal：cell report

IF:7.8

摘要：精子发生是一个复杂和高度动态的细胞分化过程，对雄性生殖至关重要，其过程由精原干细胞维持。尽管一些确定的精细胞类型的基因表达模式已经描述，但是精子发生过程中的完整连续的基因模式尚未有人探究。我们使用了62000个来自未成熟和成熟期的小鼠及人类的精子细胞做了单细胞转录图谱，这使我们可以探究ssc和精原细胞前体的发育过程，阐明雄性减数分裂和精子形成过程中的基因表达模式的整体改变，同时我们还可以获得人和鼠的精子细胞类型或者亚型之间不同的分子标记。这些转录组数据集给我们提供了丰富的资源来研究SSC。雄性减数分裂，睾丸癌症，雄性不育或者可以帮助我们建立体外的精子发生过程

介绍：

雄性生殖能力依赖于睾丸曲细精管中正常的生殖细胞的扩增和分化过程。稳定状态的精子发生过程是由生殖细胞和其支持的体细胞共同协调驱动的，这个过程起始于SSC的自我更新和分化的平和，这保证了精原干细胞池的稳态。以前的研究以bulkseq为主，这中间忽略了发育过程细胞的异质性，

本文使用了单细胞测序技术（10X平台和Fluidigm C1平台），获得了来自于1、未成熟小鼠睾丸 2、成熟小鼠睾丸 3、成年人睾丸 总共62000个细胞，可以检测到发育过程中稀有亚群的存在，同时也可以兼顾细胞的异质性

结果：

我们使用了10X的方法，同时使用了Fluidigm C1的方法（有更深度的测序）来证明我们的结果，这些研究揭示了62141个小鼠和人完整的生精过程中的基因表达的异质性。我们首先在未筛选的条件下从曲细精管的细胞悬液中获得生精细胞，然后再从中获得精原细胞精母细胞和精子细胞，非监督的聚类和拟时序分析可以看到在精子发生过程中的基因表达的发育动力学。细胞亚型的鉴定是通过细胞特异性的marker、或者通过和一些平行的单细胞实验的结果作比较得来的，后者使用的方法往往是通过FACS或者StaPut 的方法预先筛选得到相应发育时期的细胞。（重点！！）

1、稳定状态的精细胞的完整的单细胞转录组

小鼠细胞：4651 人：7134

小鼠基因9400/28625  人：7031/20939

小鼠cluster：14  人：14

2、小鼠和人成年精原细胞的异质性

从人和小鼠的生精细胞中可以获得精原细胞（表达GFRA1 KIT NANOS3 PHOX13 SALL4 ZBTB16等），将这些细胞单独取出来分析，可以得到5个人类精原细胞和10个小鼠细胞的簇，以及获得簇之间的差异基因。

同时使用ID4-eGfp转基因小鼠来获得纯净的精原细胞，在未成熟的小鼠中，具有分化能力的ssc几乎都来自于ID4-EGFP阳性的细胞，因此这个具有这个marker的转基因鼠结合FACS可以获得较高纯度的精原细胞。而人精原细胞的获得是利用了以前报的marker来进行的。通过此步筛选得到了6945个小鼠细胞和11104个人类细胞，同时使用了10X的方法及非监督的聚类最终得到14个鼠的簇和10个人的簇，同时平行的Fludigm C1单细胞测序结果验证了10X的方法。（重要！！）

3、精原细胞的发育顺序

拟时间分析的结果通过已知的marker的表达来验证，比如精原细胞中都表达的DDX4，在未分化的精原细胞中表达的GFRA1 ID4 NANOS2等以及在分化中的精原细胞中表达的DMRT1 KIT NANOS3 STRA8等。有趣的是尽管stra8在未分化精原细胞向分化中的精原细胞的转化中有重要作用，但其在二者的细胞中却很难被检测到。

在拟时序分析、marker基因表达等方面的验证下，小鼠的精原细胞的发育轨迹图谱是可信的。有趣的是，在人和小鼠精原细胞被检测到的公有的14688个同源基因中，只有286个基因存在显著性差异，而这些基因中在人体内高表达的主要的功能是参与mRNA的转运、存活和降解，而在鼠中则是氧化磷酸化和蛋白酶体功能等生物学过程。

4、干细胞和分化中的精原细胞的命运的信号和代谢驱动（精原细胞）

我们发现一些典型的SSC的marker（GFRA1 ID4 ETV5 NANOS2 PAX7 TSPAN8 RHOX10 ZBTB16等）都在拟时间分析得到的3cluster中，同时还有一些新的marker基因如DUSP6 EPHA2 PTPN13 PVR等，其中这些基因会参与代谢的调控和细胞的增殖行为，如DUSP6是调控MAP激酶活性的磷酸酶等，基于这些发现我们认为细胞内信号通路的调控对SSC的功能的是非常重要的。

（其他基因簇也做了类似的解释，不赘述）

5、减数分裂过程是受代谢和信号的动态调控的（精母细胞）

小鼠和人的生精细胞总集中把表达精母细胞marker基因（DMC1 HORMAD1 MYBL1 SPO11）的细胞挑出来重新聚类。最终得到9个cluster，人和小鼠的精母细胞在共表达的15684个同源基因中只有404个基因存在物种间的显著性差异。

作者重点关注了一些重要的生物学过程中的基因，如MSCI 同源染色体联会 减数分裂重组等过程

对于每个过程的解释都是基于拟时间分析过程得到的基因簇通过GO分析得到相关的词条解释的，这里不赘述

6、单倍体转录组促进精子形成（精细胞）

在精子形成过程中，持续进行的转录活动只在原型精子中发生，因为随后的基因组浓缩会终止转录，作者按照之前的套路，把表达精子细胞marker的细胞单独挑出来做了重聚类，以及分别做了拟时间分析获得了一些特定时间表达的基因簇。

同时也是与之前一样。将未筛选的细胞与通过staput筛选过的细胞数据混合分析。作者发现了一些减数分裂的基因在最早期圆形精子中表达，说明这些细胞正在经历减数分裂的完成及精子形成的开始，并且重新激活了X连锁的一些基因（SSXB1 SSXB2 HSFY2等），随后一些与精子运动相关的基因也被激活（CA2 car2等），以及一些特殊的蛋白如鱼精蛋白等也被激活（PRM1/2）。在人和小鼠中，参与离子通道 第二信使酶 精子运动相关的酶的基因均发现在精子形成的中期显著上调

其他分析套路如上文所述，不再赘述

7、未成熟的小鼠睾丸中精原细胞的基因表达模式与成年期的基因表达模式不同

一般认为第一波精子发生过程与成年后精子发生过程是不同的，因此我们就通过比较P6阶段的小鼠和成年小鼠生殖细胞来寻找其中的差异，同样的，在P6鼠中使用未筛选和筛选的方式各得到3466和9628个细胞，并通过Fluidign C1测序结果进行检验

与前面分析套路相同，先使用拟时间分析找到SSC的marker，然后在该簇中找到特征i性表达的基因做注释，解释生物学过程

8、qRTPCR分析验证单细胞转录组的结果并提供了细胞特异性的分子特征

略

两个概念

first wave spermatogenesis：是指未成熟雄性个体中第一次进行精子发生的过程，这个过程是在没有形成稳定的精子发生生境的条件下完成的，其过程没有SSC阶段，是由prospermatogonia直接产生spermatogonia之后进行发育，这个过程一般认为是为了保证雄性个体尽快拥有生殖能力。

steady-state spermatogenesis：是指在成熟个体通过发育在体内建立了完整的精子发生生境，可以实现体细胞与生殖细胞的相互调控的过程，同时该过程还存在prospermaotogonia发育成SSC，之后存在SSC自我更新和分化spermatogonia稳态平衡。这个过程的建立保证了雄性精子过程可以高度有序地贯穿整个雄性个体的生命周期。

工具参数：

10x数据和FPKM的smart-seq数据均直接导入seurat2.3.0

筛选标准：200genes/cell   3cell/gene

lognormal/scaledata     秩和检验，logFC>0.25