为合成靶向碳酸酐酶IX(CA IX)的多肽探针68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10,建立68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的标记及质控方法,对pH和前体多肽DOTA-CA IX-P1-4-10浓度对标记率的影响进行研究,确定68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的标记条件为:反应体系的pH为4.0～5.0(n=6),多肽DOTA-CAIX-P1-4-10浓度为15.0～40.0 mg/L(n=6),反应温度为100 ℃,反应时间10 min。产品为无色澄明液体、无可见异物,pH为5～7(n=6),放化纯度>99.0%(n=6),比活度为1.0～5.0 GBq/μmol(合成结束后)(n=6)。探针的脂水分配系数为-2.07±0.01(n=6),具有良好的亲水性。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10在生理盐水和胎牛血清中孵育4 h,放化纯度>95.0%,具有良好的体外稳定性。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10无异常毒性。初步评价结果表明,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10标记方法简单、放化纯度高、性质稳定、无异常毒性,具有开展进一步研究的价值。
关键词：68Ga-标记;多肽;碳酸酐酶 IX(CA IX)
碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX, CA IX)是一种与肿瘤相关的跨膜金属酶[1]。CA IX通过调节CO2和H2O生成碳酸氢盐与质子的可逆反应降低肿瘤细胞外环境的pH,肿瘤细胞黏附力也随之降低,该现象促进了肿瘤的转移和侵袭[2]。除胃肠黏膜组织外,正常组织中几乎没有CA IX的表达[3]。CA IX在多种实体瘤中过表达,如肾癌、宫颈癌、头颈部癌、乳腺癌和肺癌等[4],因此CA IX是肿瘤诊断的理想靶点。
近年来,以CA IX为靶点的小分子、抗体和多肽类放射性分子影像探针均被广泛报道[5-6]。小分子抑制剂类探针有着较高的结合亲和力和较短的血液半衰期,使其成为开发靶向CA IX探针时有吸引力的候选药物[4]。但由于碳酸酐酶亚型之间的高度同源性,小分子抑制剂类探针开发时面临着靶向特异性的重要挑战[7]。目前小分子探针18F-VM4-037已经进入临床实验,然而更多研究显示该探针的肿瘤摄取与背景组织相当[8]。Lau等[9]合成了小分子探针18F-AmBF3-ABS,通过PET/CT显像实现了HT29肿瘤的可视化,但图像显示靶/非靶比值较低。抗体类探针具有优异的靶向特异性,且在非靶组织中呈现低摄取,已被广泛应用于成像领域。多种靶向CA IX的抗体探针已进入临床实验阶段,如124I-girentuximab的PET/CT显像可以准确无创地识别肾透明细胞癌的病灶,可为肾癌患者制定诊疗计划提供帮助[10]。但由于抗体类探针分子量较大,肿瘤穿透能力相对较差且血液清除缓慢,导致早期显像的靶/非靶比值低,以及体内代谢时间长引起的高辐射毒性[11]。
多肽类探针分子量适中,靶向性良好,并能实现在血液中快速清除,具有良好的药代动力学性质,因此放射性标记肽在核医学影像中越来越受到关注[12],但靶向CA IX多肽类探针的报道较少。课题组曾利用点击化学方法制备放射性标记肽18F-CA IX-P1-4-10[13],micro PET/CT显像结果显示,探针可以特异性的识别肿瘤中CA IX阳性区域,但腹部器官对该探针具有较高的摄取,不利于腹部转移灶的诊断,这可能是该探针稳定性差导致。
本研究针对多肽探针18F-CA IX-P1-4-10体内外稳定性差的问题,对多肽结构进行进一步的优化和修饰,并利用正电子核素68Ga进行标记。对68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的制备方法、质量控制和体外稳定性进行初步研究,以期获得一种多肽类的CA IX靶向放射性分子影像探针。
1 实验方法
1.1 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的放射化学合成
将前体多肽DOTA-CA IX-P1-4-10溶于生理盐水,制成浓度为1 mg/mL的溶液备用。用5 mL 0.1 mol/L HCl淋洗68Ge/68Ga发生器,收集68Ga3+的淋洗液以备标记使用。
68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的合成方法示于图1。在68Ga-HCl淋洗液中,加入多肽DOTA-CA IX-P1-4-10溶液,然后用1 mol/L乙酸钠溶液调节反应体系的pH,加热振荡反应。反应结束后冷却,反应溶液通过Light C18柱,用10 mL超纯水洗去杂质和盐分,用1 mL体积分数为20%的乙醇淋洗Light C18柱,收集产品并用生理盐水稀释,通过0.22 μm一次性无菌滤器过滤后备用。
1.2 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的质量控制
取产品适量,目视观察产品的颜色、澄清度,在澄明度仪下检测产品的可见异物;利用广泛pH试纸测定产品的pH;采用Radio-TLC和Radio-HPLC法对产品进行鉴别并测定探针的放射化学纯度;采用Radio-HPLC法测定产品的比活度。本研究中比活度的计算方法为:探针比活度=探针的活度/活性分子的物质的量(GBq/μmol)。
Radio-TLC分析方法如下:以体积比为1∶1的甲醇和水溶液配制的1 mol/L的乙酸铵溶液作为展开剂,以ITLC-SG色谱纸为固定相,展开距离为6 cm。Radio-HPLC分析方法如下:流动相A为H2O(0.1% TFA),B为乙腈。采用等梯度洗脱:0～10 min,18% B,流速为1 mL/min,紫外检测波长为220 nm,进样量为10 μL,柱温25 ℃。
1.3 脂水分配系数(Log P)
将500 μL纯化后的68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10(3.7 MBq)产品加入到等体积的正辛醇中,混合物在室温下充分混匀,经离心后静置分层。从水相和有机相各取样100 μL分别置于γ计数管中,用γ计数器测定放射性计数。共进行六组平行实验,采用下面公式计算Log P=log(γ正辛醇 /γ生理盐水)。其中γ正辛醇为正辛醇层取样中的γ计数,γ生理盐水为生理盐水层取样中的γ计数。
1.4 体外稳定性
将500 μL探针68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10(约14.8 MBq)溶液,分别加入1 mL生理盐水和1 mL胎牛血清中,37 ℃下孵育,分别在0.5、1、2、3、4 h取样,采用Radio-TLC检测其放化纯度,以评价其体外稳定性。
1.5 异常毒性
取正常小鼠(ICR小鼠,雄性,江苏华创信诺医药科技有限公司),体重20.0～22.0 g(n=5),每只小鼠在5 s内经静脉注射500 μL 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10(37 MBq)产品溶液,给药后饲养观察48 h,考察小鼠的存活情况。
2 结果与讨论
2.1 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的放射化学合成
2.1.1 pH的选择 在前体浓度为75 mg/L、反应温度为100 ℃、反应时间10 min时,考察反应体系的pH对标记反应的影响,标记率随pH的变化规律示于图2。当反应体系的pH在4.0～5.0之间时,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的标记率均>95.0%,当反应体系的pH为4.5时,标记率最大为97.8%。当反应体系的pH>5.0时,随着pH增加,标记率显著下降。这是由于在相对较高pH条件下,68Ga3+与反应体系中的OH-产生大量的镓胶体,致使标记率大幅降低。
2.1.2 多肽DOTA-CA IX-P1-4-10浓度的选择 在pH为4.5、反应温度为100 ℃、反应时间为10 min时,考察多肽DOTA-C A IX-P1-4-10浓度对标记反应的影响,标记率随多肽浓度的变化规律示于图3。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的标记率随着多肽浓度的增加而增加,当反应体系的多肽浓度大于40.0 mg/L时,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的标记率在95.0%以上,标记率不再随多肽浓度的升高而显著增加。
2.1.3 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的标记条件确定 通过对标记条件的探索研究,综合考虑产品的放化产率和比活度,确定68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的标记条件如下:反应体系的pH为4.0～5.0,多肽DOTA-CAIX-P1-4-10浓度为15.0～40.0 mg/L,反应温度为100 ℃,反应时间10 min。当多肽浓度为15.0 mg/L时,标记率为(86.8±2.7)%(n=6),对标记率的Radio-TLC检测谱图示于图4,反应体系中除游离的68Ga3+外,未见其他放射性杂质生成。
2.2 质量控制
经检测,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10溶液为无色澄清液体、无可见异物,pH为5～7(n=6)。通过Radio-TLC对产品进行检测,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的比移值(Rf)为0.4～0.6(n=6),与前体多肽DOTA-CA IX-P1-4-10的一致,放化纯度>99.0%(n=6),谱图中未见明显的放射性杂质(图5a)。通过Radio-HPLC对产品进行检测,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的保留时间为4.0～4.2 min(n=6),与前体多肽DOTA-CA IX-P1-4-10的保留时间一致,放化纯度>99.0%(n=6),无明显的放射性杂质(图5b)。产品在合成结束时,紫外谱图示于图5c,比活度为1.0～5.0 GBq/μmol(n=6)。
2.3 脂水分配系数(Log P)
68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的脂水分配系数为(-2.07 ± 0.01)(n=6),与68Ga标记多肽类化合物的脂水分配系数相近[14-15],表明该探针具有良好的亲水性。
2.4 68Ga-DOTA-CAIX-P1-4-10的体外稳定性
68Ga-DOTA-CAIX-P1-4-10在生理盐水和胎牛血清中的稳定性结果示于图6。37 ℃条件下,于生理盐水和胎牛血清中孵育4 h,68Ga-DOTA-CAIX-P1-4-10的放化纯度均>95.0%,表明68Ga-DOTA-CAIX-P1-4-10在生理盐水和胎牛血清中具有良好的稳定性,较本课题组曾报道的靶向CA IX的探针18F-CA IX-P1-4-10的体外稳定性显著提高[13]。
2.5 异常毒性
异常毒性实验结果表明,5只小鼠在给药后48 h全部健存,无异常反应。
3 结论
本研究对靶向CA IX的探针68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的合成条件、质量控制、脂水分配系数及体外稳定性进行了初步研究。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的合成反应简单、耗时短,10 min标记率可达到(86.8±2.7)%(n=6),纯化后放化纯度>99.0%。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10在生理盐水和胎牛血清中37 ℃孵育4 h,放化纯度均>95.0%,表明其具有良好的体外稳定性。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10无异常毒性。初步评价结果表明,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10具有进一步的体内生物学评价研究的价值。
免责声明：本文为行业交流学习，版权归 原作者所有，如有侵权，可联系删除。
