肿瘤FLASH放疗的作用机制、挑战与机遇
Vozenin, MC., Montay-Gruel, P., Tsoutsou, P. et al. Mechanisms, challenges and opportunities for FLASH radiotherapy in cancer. Nat Rev Cancer (2025). https://doi.org/10.1038/s41568-025-00878-9
摘要
FLASH放疗通过超高剂量率照射在精准靶向肿瘤的同时保护健康组织，有望提升患者生活质量与治疗效果。然而，健康组织与肿瘤对FLASH放疗的差异性敏感机制仍未明确。本文提出假说：FLASH放疗能够基于健康组织与肿瘤间细微的功能性及结构性生物学差异进行区分。我们发现了受FLASH放疗保护的各类健康组织中存在的共性特征——这些特征可能在肿瘤发生过程中丢失。
我们进一步提出，一类称为"长寿命蛋白"的特殊蛋白质构成关键辐射分解靶点，它们普遍存在于对FLASH放疗耐受的健康组织中，却在肿瘤中缺失。基于结构视角的假说还指出，肿瘤及细胞外基质刚度会影响对放疗剂量率变化的敏感性——刚度更高、密度更大的促纤维增生型肿瘤比弹性较好的肿瘤对FLASH放疗更敏感。
通过实验验证这些概念，或可揭示一种新颖且普适的辐射效应作用机制，进而通过筛选对FLASH放疗预期响应最佳的肿瘤亚型，为临床试验设计提供理论依据。
前言
在十九世纪末 X 射线和放射性的初次发现之后，放射治疗迅速成为一种强有力的抗癌策略。自那时起，人们开发了更加复杂的方法、工具和设备，以更安全、更有效的方式对电离辐射进行表征和递送。如今，放射治疗已成为癌症治疗中基础且具成本效益的重要支柱，超过 50% 的癌症患者会在根治性或姑息性治疗中接受放疗¹。
然而，尽管影像学和治疗计划不断进步，许多接受根治性或辅助放疗的患者仍会出现局部复发或疾病进展，这被称为放射抗性²。此外，放疗还会引起急性或迟发性的毒性反应，需要加以重视，因为这些反应会显著影响患者的生活质量³。当前，通过影像引导和适形放疗实现的治疗提升似乎已趋于平台期，仅依靠提高放疗剂量递送的精确性，难以在不增加毒性的情况下治愈放射抗性肿瘤或阻止复发。
然而，大约十年前，我们提出了 FLASH 放疗，这是一种旨在拓宽放疗治疗窗的全新方法⁴。尽管其名称全部使用大写字母，FLASH 并不是一个缩写，而是由一组物理参数和生物学效应共同定义的。其核心物理特征是“超高剂量率”，即治疗剂量在毫秒甚至更短时间内完成递送，剂量率高于 100 Gy/s，可使用电子束、质子束或 X 射线（见 Box 1）。这与传统放疗的剂量率形成鲜明对比，后者递送相同剂量通常需要数分钟，剂量率仅为 1–4 Gy/min（图 1）。
这种超高剂量率带来的生物学结果是：在有效消灭肿瘤细胞的同时，最大限度减少对健康组织的损伤。尽管关于超高剂量率对健康组织的保护作用已有报道⁵,⁶，但当 FLASH 放疗被证明能够在同系模型中清除肺部肿瘤，并延缓异种移植的皮下乳腺癌和头颈部肿瘤的生长，同时保护正常肺组织⁴ 时，其真正的潜力才真正引起广泛关注。随后这种差异性的生物学效应被命名为“FLASH 效应”。
值得注意的是，在随后使用电子束、质子束和 X 射线开展的实验研究中，大多数肿瘤对 FLASH 与传统剂量率放疗同样敏感，而健康组织则始终能从 FLASH 放疗中受益（综述见文献 7,8）。目前，一些能够在生物系统中稳定诱导 FLASH 效应的关键物理参数已被明确并用于前临床研究；然而，这些参数能否扩大到临床应用仍在研究中。
在本文中，我们将重点讨论导致 FLASH 放疗差异性效应的潜在机制。首先，我们回顾了早期的物理化学假设以及迄今为止研究的生物学机制，但发现这些机制都无法对 FLASH 效应给出全面解释。随后，我们提出新的研究方向，并假设 FLASH 放疗可以作为一种物理探针，用来揭示健康组织与肿瘤组织之间微妙的结构差异。
我们提出，组织的初始结构与力学特性可能驱动 FLASH 放疗的差异性效应，而这一效应可能会被不同的代谢改变进一步放大。为支持这一假设，我们将指出那些在已知可被 FLASH 放疗保护的多种健康组织中普遍存在的共同特征。接着，我们将探讨这些特征是否会在肿瘤及其微环境中丢失或缺失。
我们会依据健康组织中存在、但肿瘤中缺乏的长寿命蛋白（LLPs）以及组织刚度差异来阐述我们的结构假设。最后，我们将基于这些假设提出相应的治疗学指征，为更高效、危害更小的放疗策略铺平道路。
临床意义
基于 FLASH 放疗在多种动物模型和不同组织中的前临床疗效⁹，两例病例报告以及首个临床研究¹⁰–¹² 已经证明利用现有加速器进行 FLASH 治疗在临床上是可行的。一名皮肤浅表性淋巴瘤患者使用实验性电子束（Oriatron eRT6；见 Box 1）接受了单次 15 Gy 的电子 FLASH 放疗，仅照射单个病灶¹⁰。将这一 FLASH 剂量与同一患者其他病灶接受的常规剂量率放疗相比，结果显示急性反应无差异，2 年随访无不良反应，并实现了总体肿瘤控制¹¹。
另一项可行性研究（FAST-01）中，十名四肢骨转移患者成功通过经临床质子束线优化的 FLASH 放疗接受了单次 8 Gy 的照射¹²。在这两例病例报告和首次临床研究中，使用的 FLASH 放疗剂量与常规放疗相同，且这些剂量已知引起的毒性极低。这是向临床转化 FLASH 放疗的必要步骤，并证实其在人类中不会引发意外毒性。
紧接着的 I 期临床试验 FAST-02 使用同一质子 FLASH 放疗束线，目前正在进行中，计划对胸部骨转移患者实施单次 8 Gy 的照射（文献 13,14）。另外，两项使用电子束 FLASH 放疗的试验也已启动：IMPulse 试验¹5，一项 I 期试验，用于评估用于黑色素瘤皮肤转移的单次分割 FLASH 放疗的最大耐受剂量；以及 LANCE 试验¹6，一项随机的 II 期试验，比较 FLASH 与常规剂量率放疗在治疗皮肤基底细胞癌和鳞状细胞癌中的效果，使用单次或多次分割方案¹7。
最终，仍需要更多临床试验来证明 FLASH 放疗的疗效，它有潜力满足三个尚未满足的临床需求（见 Box 2）。第一，FLASH 放疗有望通过剂量提升来治愈对放疗耐受、基线疗效较差的肿瘤，如肉瘤和其他常见癌种。通常这些肿瘤在接受约 60–70 Gy 的放疗后会出现反应，但患者仍常常复发¹⁸。FLASH 放疗为进一步提高剂量以实现治愈性目的提供了机会，因为剂量率提升与局部控制率改善相关¹⁹。
第二个未满足的临床需求是有效治疗复发且曾接受过放疗的疾病，因为再次放疗会显著增加严重毒性的风险²⁰。近期在无肿瘤的小鼠模型中开展的 FLASH 二次照射研究结果显示，在皮肤、肠道和骨组织中均具有良好耐受性，支持将 FLASH 放疗用于治疗肉瘤及盆腔肿瘤²¹。
第三个未满足的临床需求是发展避免损伤剩余器官组织或避免因肿瘤而需要整体切除器官的治疗策略，例如直肠癌治疗中常见的手术。若 FLASH 梯度束能实现三维适形（见 Box 3），并且能够分割照射（见 Box 4），在允许健康组织在剂量间隔中修复的同时增强肿瘤细胞杀伤，则这些改进将使所有癌症患者受益。将 FLASH 放疗与适形照射及分割照射结合预计将进一步提升治疗指数。
除了这些临床需求之外，一个务实的应用方式是将 FLASH 放疗用于目前采用常规放疗并能以中等毒性实现局部控制的辅助性术后场景，例如乳腺癌患者²²。对于这类患者人群，FLASH 放疗可能进一步降低毒性并改善外观效果²³。
最后，FLASH 放疗可在极短时间内完成照射（传统放疗需 2–5 分钟，而 FLASH 只需不足 100 毫秒），且每次分割剂量更高，因此总体分割次数和治疗次数可大幅减少，从而节省患者与医务人员的时间。FLASH 的超短照射时间还可能降低因器官或肿瘤运动造成的靶区误差。例如，呼吸和肠蠕动分别会干扰胸部和盆腔肿瘤的常规放疗定位⁹。因此，引入 FLASH 放疗有望简化临床流程并降低治疗相关成本。
FLASH 效应的机制基础
物理化学假设
该领域最早的假设之一源于辐射化学，认为 FLASH 效应是一种在辐射首次与生物环境相互作用时启动的物理化学现象（见 Fig. 1）。FLASH 放疗所触发的初始物理化学反应可能会以不同于常规剂量率照射的速度产生初级自由基。
这一假设已在无细胞的水相体系中得到测试。研究者以 H₂O₂（作为辐解自由基反应的次级终产物的替代标志物）为指标，使用脉冲电子束、质子束和 γ 射线，在 FLASH（~100 Gy/s）与常规剂量率（0.1 Gy/s）条件下考察辐照效应²⁴,²⁵。结果显示，当剂量率从 0.1 提升至 100 Gy/s 时，H₂O₂ 的初级辐解产率并未受到影响。
然而，当使用极高能电子（VHEE；电子能量 >100 MeV）将剂量率提升至 10⁹ Gy/s 以上时，H₂O₂ 的初级产率反而降低，这提示电离轨道与刺激点（spurs）重叠导致自由基快速复合²⁶。
在初级产率之外，导致 H₂O₂ 生成的后续化学反应动力学似乎对剂量率敏感。但相关研究结果相互矛盾。早期研究发现，在高氧条件下，使用超高剂量率（5×10⁶ Gy/s）脉冲电子束相比低剂量率 γ 射线（1×10⁻³ Gy/s）会产生更多 H₂O₂²⁷,²⁸。而最近的研究却报告，在大气氧浓度（2.5×10⁻⁴ M）下、剂量率范围 100 至 10¹¹ Gy/s 的 FLASH 放疗会减少 H₂O₂ 的次级产量²⁴,²⁵。
这些差异的意义以及它们是否会转化为生物学效应尚不明确。此外，多种混杂因素也使直接研究这些过程变得困难，包括清除剂和抗氧化剂的存在、酶反应速度的差异以及细胞内隔室化等。
值得注意的是，有关剂量率对质粒 DNA、肽和脂质影响的研究虽已有报道，但结论也并不一致。一些研究显示，在无细胞体系中，低于 10 Gy 的辐射剂量所诱导的 DNA 损伤对剂量率不敏感，即使改变束流特性（如平均剂量率、单次脉冲剂量率、束流结构、粒子类型与能量）也不会改变 DNA 损伤程度²⁶,²⁹–³¹。即便在模拟肿瘤微环境（如低氧、高 Fe²⁺）的条件下，这一结论仍成立²⁸。
然而，也有研究报告使用 FLASH 电子束（46.6 Gy/s）会减少质粒 DNA 损伤³²，或使用 FLASH VHEE 会减少单链断裂³³，但这一效应仅出现在超过 90 Gy 的高剂量条件下，远高于临床剂量。
总体来看，这些结果提示：尽管超高剂量率不会改变临床相关剂量范围内的 DNA 损伤程度，但在超高剂量率与极高剂量共同作用时，DNA 损伤可能会减少。
此外，在 FLASH 放疗背景下，除质粒外，脂质和蛋白质等其他生物分子受到的影响研究相对更少。然而，这些备用分子靶点在无细胞体系中的 FLASH 影响已被一定程度地探索³⁴,³⁵。
例如，在胶束和脂质体中，FLASH 辐照后氧化水平几乎为零，而在常规剂量率辐照下，脂质过氧化的终末产物随剂量线性增加³⁴。一项最新研究对氧脂素（oxylipins）的表达进行了量化，这是多不饱和脂肪酸经氧化生成的生物活性脂质氢过氧化物。研究发现，相较于常规剂量率放疗，小鼠肺组织在 FLASH 辐照后氧脂素水平更低³⁶。
在体外模拟实验中，这一效应在 37°C 的健康细胞中明显存在，但在肿瘤细胞或 20°C 条件下则不存在。此外，肽的氧化水平在 FLASH 辐照中亦有所降低³⁷。
另一项研究中，研究者利用基于傅里叶变换红外光谱显微技术（FTIR spectromicroscopy）的分析方法，对小鼠在接受 FLASH 或常规剂量率辐照 24 小时后的脑组织切片进行分析³⁸。结果显示，两种放射方式导致的蛋白质特征峰截然不同，呈现出蛋白质主链结构的变化，特别是酰胺 I 结合的特征信号发生改变。
具体而言，常规剂量率辐照的样本 β-折叠结构含量增加，相对于 α-螺旋结构的比例上升；而 FLASH 辐照的样本则保持与未照射对照组相似的次级结构构型。
在常规剂量率辐照样本中检测到的这些蛋白主链变化，与下列其他分子层面的改变同时出现：
核酸片段化与凝聚，
甲撑与甲基基团浓度变化，
脂质链长度变化等。
这些结果进一步支持 FLASH 放疗可能在极短时间尺度上减少对脂质和蛋白质等关键分子的氧化损伤，从而影响细胞和组织的整体辐射敏感性。
尽管简化的物理化学研究在概念上具有吸引力，但它们未能提供一个统一的机制来解释 FLASH 效应对肿瘤与健康组织产生的差异化生物效应。FLASH 放疗诱导的活性氧（ROS）水平下降——这会降低下游的过氧化反应级联，并减少 DNA、脂质和蛋白质的损伤——理论上应当同等保护两类组织，但体内观察结果并非如此。这表明，FLASH 效应的主要决定因素应存在于生物学底物中。
近期研究显示生理温度的作用³⁶，以及利用傅里叶变换红外光谱显微术（FTIR spectromicroscopy）获得的结果³⁸，都支持这样一种观点：差异化的 FLASH 效应主要与健康组织和肿瘤的结构差异有关。
一项近期基于 MRI 的研究进一步支持这一观点，该研究对小鼠健康脑组织在接受 FLASH 或常规放疗 1 年后的变化进行了观察³⁹。各种扩散指标，包括表观扩散系数和平均表观传播子，在 FLASH 放疗后未见变化，但在接受常规剂量率放疗的小鼠中明显改变。这些测量结果表明，FLASH 并未引起相同程度的结构破坏，提示突触元件和神经传递得以保留。
这些数据与之前对 FLASH 照射小鼠大脑的结构和功能评估结果相一致⁴⁰,⁴¹，而常规剂量率放疗则会造成组织损伤。
健康组织对 FLASH 的耐受性
在经典放射生物学中，对早期辐射效应敏感的器官被称为“早反应器官”，其特征是由高增殖能力且周转快速的细胞组成。这类器官包括肠道和造血系统中的细胞，如肠上皮细胞、结肠细胞和角质形成细胞。在这些器官中，辐射会破坏原有细胞，干扰细胞分裂及组织修复²⁴²,⁴³。值得注意的是，斑马鱼胚胎也可被视为早反应器官，因为它们由高度增殖的细胞构成²⁴²。
相反，那些直到较晚时间才表现出对辐射敏感的器官被称为“晚反应器官”，包括大脑、心脏、真皮和肺。这些器官由分裂频率较低的细胞（如成纤维细胞和内皮细胞）或已停止分裂的细胞（如神经元和心肌细胞）组成⁴⁴。在这些器官中，损伤呈延迟性发生，主要源于血管变化、纤维化以及因修复机制受损而导致的功能逐渐丧失²⁴⁵,²⁴⁶。
因此，组织和功能性毒性的发生顺序与时间，反映了电离辐射对特定器官分子和细胞水平的损伤过程（见图 2）。
尽管FLASH放射治疗不会改变毒性的发生顺序和时间，但它提高了诱发这些毒性所需的剂量阈值，特别是在早期反应和晚期反应器官中（47-51，4, 40, 52）。尽管在某些器官中，FLASH可能并不优于传统剂量率放射治疗（例如肝脏，后文将讨论），但剂量修饰因子（DMF，也称为FLASH修饰因子）在晚期反应器官中（40, 51）大于在早期反应器官中的值（49）。这一观察结果表明，这些器官之间存在生物学差异，其中由于晚期反应组织增殖较慢，较大的DMF值转化为对健康组织的更好保护。
然而，常见的保护模式仍然存在，这可能有助于识别或排除内在的FLASH放射治疗反应元素。例如，细胞周期调控、有丝分裂、急性细胞死亡、DNA损伤与修复以及特定的分化模式，在早期和晚期反应器官中有所不同（43），这表明这些因素在介导健康组织对FLASH照射的反应中并不是至关重要的。
这一观点也得到了斑马鱼胚胎实验结果的支持（24, 54）。在这些实验中，胚胎细胞在受精后24小时内具有较强的有丝分裂活性，并能够分化成构成斑马鱼的任何细胞类型（55）。当斑马鱼胚胎在受精后4小时接受电子束或质子束FLASH放射治疗时，24小时后会出现凋亡高峰，并伴随着高频率的增殖反应。相比之下，使用传统剂量率照射的斑马鱼胚胎也会出现凋亡高峰，但没有增殖反应。
在照射后5天，只有接受FLASH放射治疗的斑马鱼胚胎展现出了保存的形态发生，表明FLASH放射治疗能够保护胚胎的修复潜力（24）。
对无肿瘤C57BL/6小鼠的FLASH放疗诱导的转录组学变化的分析结果已陆续公布[56–58]。这些结果可能有助于界定FLASH照射组织中共有的基因组模式，以及在使用相似剂量进行FLASH或常规剂量率照射的组织之间的任何相似性或差异性。
然而，这些分析受到各实验所用条件多变的影响，包括使用的FLASH模式（即电子线与质子线）、剂量率（10² - 10⁶ Gy/s）、剂量（10-40 Gy）以及实施方案（即单次或大分割）的差异。此外，用于转录组学分析的组织是在不同时间点收集的。例如，转录组分析已在17 Gy照射后第4天收集的肺组织、30 Gy照射后分别于1个月和5天收集的骨骼和皮肤组织、40 Gy照射后2周收集的心脏组织以及10 Gy或3×10 Gy照射后24小时收集的脑组织上进行。此外，还使用了各种RNA分析技术，包括批量RNA测序（用于骨骼、皮肤和心脏）、单细胞RNA测序（用于肺部）和全转录组数字空间分析。
在所有器官中，与常规剂量率照射的样本相比，FLASH样本中经典辐射诱导通路（如DNA损伤应答、p53信号传导、肿瘤坏死因子超家族诱导、细胞死亡通路以及炎症和纤维化反应）的表达水平较低。相反，在FLASH照射后，修复通路（如血管和上皮伤口愈合）得以维持，而在常规剂量率照射后则未维持。心脏和皮肤的再生通路仅在FLASH样本中独特上调。器官特异性的分化模式，如肺间质巨噬细胞、破骨细胞分化、软骨内骨形态发生以及突触可塑性，在FLASH照射后也得以维持。
这些转录组学研究的综合结果表明，与常规剂量率照射不同，FLASH照射诱导的健康组织损伤明显较轻，和/或促进了修复反应，这两个因素可能有助于维持器官功能（图3）。这些结果引出了一个重要问题：这种基因组应答是FLASH放疗特有的，还是与常规辐射剂量率相似，只是发生在更高剂量时？这个问题仍未解答，因为现有研究是在等剂量而非等毒性水平下进行的。
有趣的是，健康组织对FLASH放疗的相对抵抗性在衰老过程中仍得以保持。幼年（3周龄）[41,59]、成年（8-20周龄）[40,52,60,61]和老年（>55周龄）动物在全脑FLASH照射后均能保持相对认知敏锐度，而任何年龄段的动物在接受常规剂量率照射后都会出现不可逆的认知缺陷，其中幼年大脑最为敏感[62]。这些结果表明，衰老引起的生理变化并未改变健康组织对FLASH的反应。 例如，许多生物过程会随年龄增长而衰退，包括维持遗传和表观遗传程序的机制[63]。这些过程涵盖DNA损伤修复、端粒维持、DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑[64]。此外，影响蛋白质稳态、线粒体功能、新陈代谢、干细胞数量和功能的细胞信号通路维持也会受到影响[65]。这些过程都是应对损伤、慢性氧化应激和炎症所必需的[64]，而这些都与年龄相关疾病有关[64]。
虽然FLASH放疗后表观遗传学、染色质结构和蛋白质稳态的变化尚未得到研究，但其他机制已被探讨。与常规剂量率放疗相比，FLASH放疗还能降低大脑的氧化应激和炎症[40,66-69]；保护大脑、肺部和肠道中的干细胞库[49,52,56,57,60]；维持肺部和心脏的代谢功能[56,58]。在端粒较短的Terc基因缺陷小鼠中，FLASH放疗对辐射诱导纤维化的保护作用会消失[56]，这表明端粒酶活性可能参与诱导FLASH放疗的组织保护效应。其他机制如DNA损伤反应，在体内[47]和体外[70]实验中显示FLASH放疗与常规剂量率照射后的反应相似。
重要的是，这些研究属于相关性研究，意味着这些终点反映的是FLASH辐射暴露的结果，但不一定是FLASH效应的主要决定因素。这需要进一步研究验证。
肿瘤对FLASH放射治疗具有敏感性
尽管FLASH放射治疗引发的健康组织并发症较少，但其抗肿瘤效果与传统剂量率照射相当⁴。这种出乎意料且反直觉的差异性效应引出了两个重要问题：是什么使癌细胞对FLASH放射治疗特别敏感？以及是否所有癌细胞对FLASH放射治疗的敏感性都相同？
对肿瘤放射敏感性的理解最初基于“4R理论”，该理论描述了决定肿瘤对电离辐射反应的关键路径：DNA损伤修复（R1）、细胞周期再分布（R2）、细胞再增殖（R3）以及缺氧区域再氧合（R4）⁷¹。随后，放射生物学领域纳入了更多功能性且复杂的结果，包括由组织和细胞内在反应定义的放射敏感性（R5）、由外部因素（如氧气、药物和免疫系统）使肿瘤细胞对辐射更敏感的反应激活（R6），以及微环境外部因素的强化作用（R7）⁴³。如今，放射治疗方案仍很少根据肿瘤特异性生物学特征设计，而主要基于同一肿瘤内所有癌细胞对辐射反应相似的假设。经验表明，这一假设成立的原因是肿瘤反应主要取决于照射剂量，且更高剂量通常具有更好的杀伤效果⁷²。然而，通过更精准地描述肿瘤生物学特征并整合其机制知识，未来有望实现治疗效果的进一步提升。
尽管目前是在等剂量条件下对比FLASH与传统放疗的抗肿瘤效果⁷，但仅在部分"7R"机制中观察到差异。例如在迄今测试的所有实体瘤（肺癌、卵巢癌）和肿瘤细胞系（肺癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、头颈癌）中，FLASH与常规剂量率放疗引发的DNA损伤（R1）程度一致⁴,⁵⁶,⁷⁰,⁷²。评估DNA损伤的功能性实验——克隆形成存活实验（评估内在放射敏感性R5的金标准）也显示，在10 Gy以下剂量时，FLASH与常规照射组织的存活率相当⁴⁰。
然而，对免疫缺陷小鼠移植人原代T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）后进行全身FLASH或常规放疗的结果表明，液体肿瘤对FLASH的反应存在特殊性⁷³。在三例T-ALL患者来源的异种移植模型中，两例对FLASH放疗更敏感，一例对FLASH完全无反应但可通过常规放疗控制。这揭示了T-ALL的个体差异性，对"等剂量等效"的普适性提出挑战，也暗示FLASH与常规放疗在T-ALL中可能激活不同的抗肿瘤机制。虽然未检测照射后基因组变化，但发现这三株肿瘤细胞的内在遗传背景和核型异常存在差异。在FLASH耐药型T-ALL中，参与抑制细胞周期G2/M期转换的Gadd45B基因表达下调；而FLASH敏感型则过表达该基因，提示细胞周期重分布（R2）与再增殖潜力（R3）可能在两种放疗方式的响应差异中起作用。
Leavitt等⁷⁴在人胶质母细胞瘤细胞系（U87-MG）皮下移植模型中发现，除非通过肿瘤夹闭诱导急性缺氧，否则照射后24小时两组基因组无显著差异。在生理氧条件下，FLASH组下调细胞周期和DNA修复相关基因；而在缺氧条件下（R4），FLASH能独特维持抗肿瘤疗效，并伴随Gadd45B高表达（关联R2/R3）。这些数据表明FLASH具有更强的抗增殖与细胞静止效应（R2/R3），并能克服导致放射抵抗的关键因素——缺氧（R4）⁷⁵。
值得注意的是，目前唯一报道对FLASH无反应的肿瘤模型是液体肿瘤，这提示肿瘤微环境与结构的重要性，需进一步研究验证。
目前关于FLASH放疗对肿瘤微环境的影响研究，主要聚焦于氧张力与缺氧的相互作用（R4）以及免疫应答（R6和R7），而健康组织与肿瘤之间其他潜在的结构差异尚未探索。解释FLASH效应最主流的假说认为，超高剂量率照射可比常规剂量率更高效地耗氧（即辐射分解耗氧机制）⁷⁶。然而体外实验⁷⁷,⁷⁸、原位检测⁷⁹，以及在皮下U87-MG异种移植瘤与健康皮肤、肌肉和脑组织中的研究⁸⁰均表明，临床相关剂量（每次照射<10 Gy）引发的局部耗氧率过低，不足以影响肿瘤反应，提示辐射分解耗氧并非FLASH效应的全部机制。
另一流行假说涉及FLASH放疗可能增强免疫原性或保护循环免疫细胞（R6和R7）。虽有理学模型支持此观点⁸¹，但对原位胶质母细胞瘤大鼠模型的质子FLASH放疗显示，在等剂量条件下其循环免疫细胞保护作用与常规质子放疗无显著差异⁸²。近期研究更进一步反驳了"FLASH增强免疫原性"的观点：无论在单次或分次等剂量照射下，免疫健全与免疫缺陷动物模型中采用电子或质子FLASH束流治疗皮下/原位肿瘤时，均未发现免疫细胞招募增强或免疫抑制信号（如TGFβ表达）减弱⁸²⁻⁸⁵。这表明剂量率变化并未差异激活实体瘤的免疫细胞招募通路，亦未逆转肿瘤固有的免疫抑制信号。
与之相对，啮齿类与犬类正常组织（肺与皮肤）中观察到的FLASH效应与TGFβ生成减少相关⁴,⁵⁷,⁸⁶，反映出FLASH对免疫抑制信号的影响机制尚不明确。此问题值得深入探究：最新研究使用Math1-Cre;SmoM2+/–转基因小鼠模型发现，基于质子的FLASH放疗（常规质子放疗则不能）可通过调控脂代谢重编程巨噬细胞，逆转辐射典型诱导的免疫抑制极化，使髓母细胞瘤对GD2 CAR-T疗法增敏⁸⁷。但该研究采用的非临床相关剂量（10 Gy）及转基因模型本身具有局限性，且需考虑CAR-T疗法可能诱发认知障碍的干扰⁸⁸。尽管如此，这仍证明FLASH放疗可缓解肿瘤微环境中的免疫抑制信号，为联合免疫治疗提供了新思路。
最后一项需要深入研究的假说涉及FLASH放疗对血管系统的影响。在路易斯肺癌小鼠模型中已观察到血管层面的特定结构变化：与常规剂量率放疗相比，FLASH放疗能减少血管塌陷，并降低磷酸化肌球蛋白轻链的表达——这种蛋白质参与调控血管平滑肌收缩、血管张力与阻力、血压及组织灌注⁸⁹。这种对肿瘤血管的保留作用可能促进杀伤性免疫细胞的浸润，但研究未发现其与抗肿瘤效果增强直接关联。
在健康脑组织中，常规剂量率放疗会通过破坏血脑屏障细胞的紧密连接蛋白，诱发持续性血管异常⁹⁰；而FLASH放疗可减少神经源性区域微血管的细胞凋亡，维持occludin、claudin-5等紧密连接蛋白的表达⁶⁹。这种微血管保护效应可能在维持肿瘤控制的同时，有助于保护认知功能。
综上所述，现有临床前数据表明癌细胞与健康组织对FLASH放疗的反应存在差异。虽然剂量率影响健康组织损伤的诱发与表现，但所有比较等剂量FLASH与常规放疗对肿瘤作用的研究均证实，总剂量仍是抗肿瘤效果最关键的决定性因素。
FLASH效应的新假说：长寿命蛋白（LLPs）
某些器官（如大脑中的神经元或心脏中的心肌细胞）含有可在生物体整个生命周期中持续存在的有丝分裂后细胞。长寿命蛋白（LLPs）同样能伴随生物体终身存在⁹¹,⁹²，被认为可保护这些有丝分裂后细胞免受疾病和衰老引起的转录与翻译应激的影响⁹³–⁹⁵。由于研究表明LLPs对通常降解蛋白质的生理过程具有抵抗性⁹¹,⁹²，我们推测它们对FLASH辐射引起的降解也具有抗性。由于LLPs的存在于发育早期已确定⁹⁴，而大多数肿瘤源于终身突变积累，因此肿瘤预计不含有LLPs。即便存在，其水平也远低于对应健康组织。这一关键差异是本假说的基础，提示FLASH效应的机制可能涉及这类特殊蛋白对剂量率变化的差异性敏感——而在假设缺乏LLPs的肿瘤中，这种差异将不产生影响。
在传统放射生物学范畴中，将DNA以外的细胞成分（如蛋白质）视为辐射效应关键靶点的观点长期备受质疑。由于蛋白质在细胞内持续更新，其在可遗传变化或生物体生命周期中持续功能效应的重要性常被忽视。但健康组织与肿瘤间LLPs的差异性存在对这一教条提出了挑战。
Hetzer实验室通过¹⁵N同位素标记技术，已在大脑、胰腺和内皮细胞中鉴定出LLPs⁹²,⁹⁴,⁹⁵。值得注意的是，参与氧化磷酸化、线粒体接触点及嵴组织系统复合体的线粒体蛋白、核孔蛋白、组蛋白及髓鞘成分均被发现含有半衰期极长的LLPs⁹⁵,⁹⁶。具体而言，线粒体蛋白质组更新慢于细胞蛋白质组，其中40%线粒体蛋白为LLPs，其寿命超过细胞蛋白平均水平⁹³。线粒体LLPs是嵴结构的核心组分，被认为支撑其结构与功能⁹³,⁹⁷，同时构成电子传递链（特别是复合体I的膜臂和复合体III二聚体）的重要组成部分⁹³。尤其值得注意的是，复合体I膜臂中的多数线粒体LLPs在超复合体中稳定性增强，能抵抗衰老相关的线粒体功能氧化降解⁹³。
大脑作为高能耗且富含有丝分裂后细胞的器官，其LLPs比例显著高于快速增殖组织⁹²,⁹³。由于大脑在多种功能终点（如认知或长时程增强）上表现出显著的FLASH保护效应（剂量修饰因子约1.4），这进一步支持FLASH保护效应与LLP含量相关，部分源于LLPs对FLASH辐射降解的抗性强于常规放疗（附图1）。该假说也与晚反应组织比早反应组织更显著呈现FLASH效应的现象一致⁷,⁹⁸。此外，几乎所有受FLASH辐射保护的正常组织均存在LLPs⁸，而对FLASH敏感的肿瘤可能缺乏LLPs，这为假说提供了进一步支持。
由于目前无法通过实验手段直接操控LLPs，阻碍了验证其在健康组织中功能作用的直接研究路径。值得注意的是，有研究提出将低¹⁵N/¹⁴N同位素比值作为微生物活检中的诊断标志物，用以区分肿瘤与健康组织⁹⁹。这表明类似的¹⁵N/¹⁴N同位素标记技术可应用于早发性及晚发性自发肿瘤模型，以更系统地验证这一诊断方法。此类研究亦可验证"肿瘤中缺乏LLPs"的假说。显然，需要开展长期研究来克服LLPs评估中的固有局限，这对于精确测量LLPs衰变的剂量率依赖性、检验LLPs的特定翻译后修饰是否参与FLASH辐射后健康组织的保护效应至关重要。
FLASH效应也可能部分通过蛋白质稳态的变化来解释，例如辐射后自噬和/或靶向溶酶体降解途径的改变。这些设想大多可转化为可检验的假说。例如，若该机制成立，则FLASH辐射应能维持LLPs的半衰期，而常规剂量率放疗会加速其降解，导致¹⁵N标记蛋白的衰变加快。同理，我们可能发现常规放疗后靶向溶酶体降解的LLPs产量较FLASH放疗更高，这也能印证LLPs对超高剂量率辐射的耐受性。或许验证本假说最引人入胜的方式是研究肝脏——截至目前，肝脏是唯一尚未发表FLASH辐射反应数据的健康组织，也是已报道中唯一缺乏LLPs的组织⁹⁴,⁹⁶。尽管我们认为LLPs为FLASH效应提供了合理机制解释，但这仍需进一步实验证实。
组织的生物物理特性
健康组织与肿瘤组织在结构上存在差异：健康组织通常排列有序，具有明确且相对弹性的基底膜及单层上皮细胞结构；而肿瘤组织（尤其是实体瘤）缺乏细胞有序性及基底膜，细胞外基质（ECM）更致密、僵硬且紊乱¹⁰⁰,¹⁰¹。鉴于器官系统通过进化已实现对生理过程的最佳稳态调控，有必要思考组织结构变化是否以及如何与FLASH效应相关联。目标组织的内在特性（如致密的ECM）可能通过调控生物力学力（压力、剪切应力及形变能力）影响组织对FLASH与常规剂量率放疗的响应差异¹⁰¹。
从电离辐射与组织的相互作用机制看，大部分辐射能量会转化为热能，导致受照组织局部温度升高。测量显示质子或重离子径迹附近温度可上升数千开尔文¹⁰²，引发组织热膨胀并产生声发射。有趣的是，声学测量已被提议作为剂量测定工具，并成功用于FLASH辐射剂量监测¹⁰³。但这些声发射同时会产生压力波前，其强度与瞬时剂量率及组织特性（尤其是密度）呈线性相关。Lascaud和Parodi通过数字模拟分析提出，FLASH辐射产生的热声发射振幅足以诱发声空化、声振荡及可能导致组织器官严重损伤的气泡溃灭¹⁰⁴。
在一项针对猫鼻平面鳞癌的FLASH放疗临床研究中，该理论得到印证——患猫出现了放射骨坏死¹⁰⁵。研究表明，鼻腔内的组织异质性（如窦腔、口腔及颌骨中的气腔）可诱发振幅高于初始压力的峰值压力，进而导致声共振和组织塌陷¹⁰⁶。质地更坚硬的实体瘤可能更易受此过程影响。
另一模型研究指出，超高剂量率照射时组织中产生的密集粒子（电子和质子）会降低自由基反应性¹⁰⁷。在结构规整的健康组织中，FLASH放疗产生的高密度粒子群可在局部形成高浓度自由基，其近距离分布增强复合概率，从而淬灭自由基毒性，保护组织；而在肿瘤中，组织高刚度会限制自由基扩散能力，降低复合过程，维持毒性效应。
尽管这些假说颇具启发性，但体内功能验证仍具挑战。一种可行方案是采用具有致密/紊乱ECM的组织（如促纤维增生性肿瘤或高基质密度组织）进行研究。根据此理论，促纤维增生或基质丰富的肿瘤（如肉瘤和胰腺癌）对FLASH照射应比疏松弹性结缔组织器官中的肿瘤更敏感。
分析健康大脑、肺和肠道（这些功能、结构及放射生物学特性各异但均对FLASH放疗耐受的组织）的ECM组成，或可揭示哪些ECM成分赋予健康组织保护力。值得注意的是，大脑中导致组织僵硬的纤维状胶原含量低，而促进组织弹性的成分（如糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、生腱蛋白-C及基质金属蛋白酶）却是大脑¹⁰⁸、肺¹⁰⁹和肠道¹¹⁰ECM的常见组分，这可能减弱FLASH放疗诱导的生物力学力。
已知致密、纤维化且僵硬的基质可通过改变机械信号通路和细胞粘附影响细胞对放疗等抗癌治疗的反应¹¹¹，还能隔离ROS、细胞因子和损伤相关分子模式等应激分子，间接损害肿瘤氧合与放疗响应¹¹²，从而增强FLASH辐射诱导的机械约束与肿瘤细胞杀伤。
与此吻合的是，多项FLASH放疗研究已在皮下移植瘤（通常被致密纤维帽包裹⁴,⁷⁴,⁸³,⁸⁴,¹¹³,¹¹⁴）及促纤维增生性胰腺导管腺癌模型¹¹中成功开展。值得注意的是，目前唯一报道的FLASH抗性肿瘤T-ALL¹¹⁵正是无间质的淋巴瘤。这些数据共同表明，肿瘤硬度升高与基质致密性可增强对FLASH辐射的敏感性；相应地，由于健康组织具有相对弹性，除成熟骨骼外所有健康器官均可免受FLASH放疗引发的毒性与细胞死亡。
结论与未来展望
现有功能学与临床前证据支持FLASH放疗在癌症治疗中的应用，但健康组织为何能抵抗超高速辐射传递却在常规剂量率照射下易损的关键因素仍未明确。尽管本文提出了组织结构和生物力学成分（如LLPs和ECM刚度）可能发挥作用的观点，但这些方面仍需通过复杂的生化与生物物理方法进行正式验证。一个相关且同等重要的问题涉及高能电子、光子和带电粒子在组织内相互作用的时间动力学机制。
这类研究需要物理学、化学和生物学交叉领域的多学科团队合作，以明确FLASH的健康组织保护效应及其抗肿瘤效果是否在更高剂量率（如兆戈瑞/秒级以上）时达到平台期。这对于界定临床最佳时间参数、最大化FLASH放疗对癌症患者的获益至关重要。粒子加速器技术的进步将对未来FLASH的全球临床应用起决定性作用，因为现有技术仍存在局限（专栏1）。此外，产生超高剂量率辐射需要大型、沉重且昂贵的高功率设备，需建设专用设施⁸。
截至目前，FLASH放疗已为提升放疗疗效与安全性开辟了新路径。符合临床空间限制的新技术正不断涌现¹¹⁶,¹¹⁷。尽管在竞争激烈的肿瘤临床试验背景下患者招募可能存在挑战，但针对可能受益于器官保留照射的患者或适合复发时安全再照射的患者群体进行招募更具可行性。最终，全面阐明FLASH效应的生物学机制与物理学参数，将是突破当前临床转化障碍的关键。这将促进优化患者筛选与联合治疗策略，推动有效临床转化，从而提升治疗效果、降低健康组织毒性并改善患者生活质量。
专栏1 | FLASH辐射加速器的技术现状与发展路径
FLASH放疗的临床转化需要能够实现FLASH照射的加速器技术取得重大进展⁸。目前大多数临床前观察数据来自第一代FLASH实验电子直线加速器（如Kinetron和Oriatron），这些设备具有中能级特性（4-6 MeV），可产生剂量率范围从0.01 Gy/s至10⁶ Gy/s的脉冲电子束，实现从分钟级到微秒级的照射时长。但由于其组织穿透深度有限（约1-2厘米），尚不适用于临床治疗。
第二代FLASH照射设备通过对现有放疗设备改造而来，包括：增强电源的术中电子束设备、去除滤片以维持高剂量率的临床X射线加速器，以及调整后产生更高剂量率的临床质子束。这些改良设备通常能达到100 Gy/s量级的超高剂量率，实现毫秒级照射，为早期临床应用提供了可能。其中质子FLASH束流还能治疗深部肿瘤。
第三代FLASH设备目前正在研发中，旨在治疗大范围照射野（10×10厘米及以上）和深部肿瘤。这些设备采用超高压电子束（能量超过100 MeV的电子）、激光驱动电子/质子束、超导材料或紧凑型同步加速器产生X射线，剂量率覆盖100 Gy/s至10¹¹ Gy/s范围，可实现毫秒至皮秒级的极速照射。
虽然小鼠实验中常引用40 Gy/s作为产生FLASH生物效应的阈值，但患者的最佳剂量率尚未确定。现有研究表明，将照射时间从1分钟缩短至100毫秒即可改变生物响应⁵²，而进一步压缩至100微秒甚至1皮秒的影响更难预测。尽管当前证据表明毫秒-微秒级辐射对肿瘤保持细胞毒性同时保护健康组织¹¹⁹，但纳秒-皮秒级辐射的生物学效应仍属未知。该领域已有文献进行系统综述⁸，但全面表征并优化产生FLASH效应的物理参数，仍是构建下一代FLASH加速器的关键所在。
专栏2 | FLASH放疗临床决策树：优化诊疗流程与治疗选择的新范式
从确诊开始，临床医生需综合评估患者多种医疗状况以制定个体化放疗方案。在当前常规放疗存在局限性的领域，FLASH技术有望通过其独特优势带来突破性改进。如图所示，FLASH放疗预计将从多个维度提升临床诊疗效率和患者体验，最终实现整体医疗质量的优化。
最显著的改进在于：FLASH放疗能将单例患者在直线加速器上的治疗时间缩短数倍，从而大幅提升医疗机构的接诊容量。这一特性对于医疗资源有限国家的癌症治疗具有重大意义。
专栏3 | FLASH放疗与空间剂量优化的整合
常规剂量率放疗已通过技术创新实现物理剂量的精准靶向投照，包括影像引导下的肿瘤精准勾画技术、高剂量辐射聚焦投照技术，以及应对放疗中器官/组织运动的动态调整技术，这些共同提升了治疗精准度与安全性。
尽管目前尚未有将这些技术与FLASH辐射结合的实践，但其整合必将进一步拓宽FLASH的治疗窗。研究表明，X射线FLASH束流⁶⁰和质子FLASH束流⁵¹,¹²⁰的扫描照射仍能保持FLASH的保护效应，提示可通过序贯束流移位实现多束FLASH射束对肿瘤靶区的全覆盖。分次照射实验（通过短间隔分剂量模拟治疗中机架复位时的暂停）发现，当间隔延长至2分钟时保护效应逐渐减弱¹²¹,¹²²，但使用剂量率约100 Gy/s的质子FLASH束流时，1分钟间隔仍能保护正常组织⁵⁸，表明≤1分钟的间隔可维持FLASH效应，是实现适形FLASH放疗的重要时间阈值。
值得注意的是，采用瞬时剂量率超过10⁶ Gy/s的电子FLASH束流（eRT6）时，即使间隔延长至10分钟仍能保护正常组织²⁶，这提示更高剂量率可能为适形技术开发提供更灵活的选择。因此，未来FLASH放疗系统很可能结合束流扫描与旋转照射技术，实现更精准的剂量适形，最终提升患者疗效。
专栏4 | FLASH放疗与剂量分次
尽管临床前研究出于实操性多采用单次FLASH照射，但早期曾普遍存在"FLASH无法分次照射"的误解。这一观点最初得到模型研究和氧耗竭假说¹²³的支持，被认为会限制其临床应用。然而后续实验证据有力驳斥了该假设，证实FLASH剂量确实可有效分次实施¹²⁴。
随着放疗领域逐渐向"大剂量、少分次"模式转变，近期研究开始探索大分割FLASH方案。电子FLASH的分次照射可延缓肿瘤进展⁶¹,¹¹⁴；在头颈癌小鼠模型中，大分割质子FLASH放疗相较常规质子放疗能减轻黏膜炎，保护唾液分泌功能和骨骼完整性¹²⁵。此外，成年小鼠（3次×10 Gy¹²⁶）和幼年小鼠（2次×10 Gy⁴¹）的大分割FLASH照射均显示出认知功能保护作用，后者对儿童脑瘤治疗尤为重要——幼年大脑对放射高度敏感且易发生远期损伤⁶²。
目前仅有一项研究探索了临床标准分次方案（单次2-3 Gy）的FLASH效应：对无瘤动物进行10次×3 Gy的全脑照射（人类脑转移瘤治疗方案），FLASH剂量率（10⁶ Gy/s）组仍保留神经元突触长期增强效应，而常规剂量率组该效应被抑制¹²⁴。这表明即使采用标准分次方案，FLASH仍能保护健康组织。虽然仍需更多研究比较不同分次方案的获益，但现有证据一致表明：FLASH放疗在剂量分次后仍可保持其治疗增益的提升。
