PiggyBac 转座子系统构建 稳定过表达细胞系 流程全解析

PiggyBac 转座子系统构建 稳定过表达细胞系 流程全解析

本节概览

一、PiggyBac 转座子的工作原理
二、双质粒系统的组成与载体设计
三、启动子与调控元件的选择要点
四、稳定过表达细胞系构建全流程（以小鼠 ES 细胞为例）
五、关键实验要点与常见问题
六、与病毒载体、随机整合方法的简要比较

引言

在前两期中，我们分别讨论了基于 CRISPR/Cas9 的基因敲除和荧光报告基因的敲入。这两种策略都是在基因组上进行定点改变——一个是破坏基因功能，一个是在特定位置插入报告基因。但在实际研究中，还有一类同样基础的需求：让某个基因在细胞中高水平、持续地表达，即稳定过表达。

过表达技术在功能基因组学中扮演着不可替代的角色。最典型的应用是拯救实验（rescue）：当敲除或敲低某个基因导致细胞出现特定表型缺陷后，将野生型目标基因重新导入细胞，观察表型是否恢复。如果表型被外源基因回补，便构成了“基因型→表型→回补恢复”的完整因果链，这是证明基因功能的最有力证据之一。在临床遗传学研究中，病人来源的突变型与野生型回补的对照实验，也是判断突变致病性的关键手段。

此外，过表达还被广泛用于以下场景：功能获得性研究——在野生型背景下高表达某个基因，观察细胞行为变化，从而推断其功能；细胞重编程与定向分化——利用特定转录因子组合（如 Yamanaka 四因子）的强制表达，将体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC），或将干细胞/前体细胞诱导分化为特定谱系；信号通路解析——通过过表达信号通路的组成型活性突变体或显性负性突变体，激活或阻断特定通路，研究其在发育和疾病中的作用；药物靶点筛选与验证——在细胞中稳定过表达候选靶基因，检测其对药物敏感性的影响等等。

传统的稳定过表达多使用慢病毒或逆转录病毒，但病毒包装步骤繁琐，插入片段大小受限，且病毒载体随机整合到基因组上，易受位置效应影响导致表达不稳定甚至沉默。

PiggyBac 转座子系统提供了一条不同的路径——不需病毒包装即可高效整合，载货容量可达数十 kb，整合后保持稳定却又可通过再次引入转座酶实现无痕切除。这些特性使其在干细胞和基因功能研究中得到广泛应用。

本文将以小鼠胚胎干细胞（mESCs）为例，系统梳理利用 PiggyBac 系统构建稳定过表达细胞系的原理和操作细节。

一、PiggyBac 转座子的工作原理

PiggyBac 最初从粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）基因组中发现，属于 DNA 转座子。它的转座机制是一种典型的“剪切—粘贴”过程，全程不需要 RNA 中间体。其核心元件只有两个：

• 转座酶（PBase）：约 594 个氨基酸，负责识别转座子两端的末端反向重复序列（ITR），催化切除和整合反应。
• 转座子序列：由 5′ PB-LTR 和 3′ PB-LTR 界定的一段 DNA，中间是待转移的货物序列。
  

https://www.systembio.com/wp/wp-content/uploads/Manual_PiggyBac_Web.pdf

工作时，PBase 结合到两侧的 PB-LTR 上，将整个转座子从供体质粒上精确切下，然后寻找基因组上的 TTAA 位点插入。整合时，TTAA 位点在转座子两侧各复制一次，形成“TTAA—转座子—TTAA”的结构。这种靶位点重复（TSD）是 PiggyBac 整合的特征性标志。

切除过程同样精确：再次引入 PBase 时，它会识别 PB-LTR 将转座子完整切出，并修复切口，使基因组恢复为单一的 TTAA 序列，不留痕迹。这一可逆整合的特性使 PiggyBac 在功能回补、重编程因子瞬时表达（随后切除）等研究场景中尤为适用。

二、双质粒系统的组成与载体设计

一个完整的 PiggyBac 过表达系统由两个质粒组成：转座酶表达质粒和转座子供体质粒。两者共转染细胞，转座酶从供体质粒上切下“目的基因＋筛选标记”的表达框，整合到基因组中。转座酶表达质粒本身不整合，在细胞分裂过程中逐渐丢失。

1. 转座子供体质粒

转座子质粒是整个实验的核心。其基本结构为：

5′ PB-LTR — [目的基因表达框] — [筛选标记表达框] — 3′ PB-LTR

下图为最常见的piggybac dual promotor 质粒图谱：

piggybac dual promotor.jpg

包含以下关键元件：

• 5′ 和 3′ PB-LTR：分别约 300–500 bp，包含 PBase 识别所需的全部序列，任何缺失都可能大幅降低转座效率。

• 目的基因表达框：启动子（CMV） + 多克隆位点MSC，MSC便于插入目的基因 CDS 。

• 筛选标记表达框：EF1α 启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因（PuroR）和GFP荧光蛋白作为报告标记，便于抗性筛选和流式分选。

• 绝缘子（Insulator）：用于阻断整合位点周围染色质环境对转基因的影响的关键元件，使得转基因能够持续表达避免发生沉默，常在 PB-LTR 内侧成对放置。

• PolyA：提供转录终止和mRNA加尾信号，增强mRNA的稳定性与翻译效率。

整个转座子总长度建议控制在 9–10 kb 以内，超过此范围转座效率会明显下降。

2. 转座酶表达质粒

一般选择 CMV 、CAG或EF1A 等强效启动子驱动 PBase 编码序列，并携带 polyA 信号。转座酶只需在转染初期瞬时表达，常规双质粒策略中转座酶载体随细胞分裂自然丢失，已足够满足大多数实验需求。也可以购买SBI 公司优化后的的Super PiggyBac Transposase质粒：

三、启动子调控元件的选择要点

在干细胞中做稳定过表达，启动子的选择直接决定表达强度和长期稳定性。
需要注意的要点如下：

• 避免使用 CMV：CMV 在多数干细胞（ES/iPSC/神经干细胞）中易因 CpG 甲基化发生转录沉默，传代数次后表达量往往骤降。CMV 仅适用于 293T 等常规细胞系的瞬时高表达。而市面上过表达质粒多采用CMV启动子，因此如果是在进行干细胞稳定过表达，后续需要将原有的CMV启动子换成其他CAG 、 CBh或EF1α等启动子。

• CAG 和 CBh 是干细胞过表达的首选：CAG（约 1.7 kb）在干细胞中表达强度高且长期稳定；CBh（约 0.8 kb）是 CAG 的精简版本，活性相当而体积更紧凑，尤其适合载体容量受限的场合。

• EF1α 是稳定的备选：长期稳定性优异，强度略低于 CAG，约 1.2 kb。其短版本 EFS（约 0.2 kb）仅适用于载体空间极度紧张的情况。

• PGK 适合驱动筛选标记或温和过表达：约 0.5 kb，稳定性优秀，强度中等，体积小巧，是筛选标记的经典驱动元件。

• UbC 提供均一的中等强度表达：约 1.2 kb，适合 CAG 强度过高导致蛋白毒性时的平衡方案。

简言之，干细胞稳定过表达实验的启动子选择优先级为：CAG ≈ CBh > EF1α > UbC > PGK，避免使用 CMV。详细对比可参考本系列的《基因过表达载体的启动子选择指南：表达强度、稳定性与适用场景》。

其他过表达载体中的常用调控元件

• Kozak序列 ：是存在于真核生物mRNA上、位于起始密码子（AUG）周围的保守序列，主要作用是增强核糖体对起始密码子的识别效率，从而显著提高翻译起始的准确性。高效的Kozak序列可使翻译效率提升数倍至数十倍，因此在过表达系统中一般建议加入。Kozak归纳的最优序列为：GCCRCCatgG，常见强Kozak示例：GCCACCatgG（-3位A，+4位G）。

• WPRE：约 600 bp，置于编码区和 polyA 之间，通过增强 mRNA 核输出和稳定性提高蛋白表达 2–5 倍，需要极高表达时建议纳入。

• IRES：内部核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site），约100–600 bp，IRES插入在两个基因的ORF之间，使核糖体能够从内部独立启动下游基因的翻译，从而实现单个转录本共表达两个或多个基因，但IRES后一个基因的表达量显著低于上游基因（约为上游的10–50%）。

• 2A 肽：当需要共表达两个蛋白时，2A 自剪切肽（P2A\T2A\E2A，约 60 bp）可使上下游蛋白以近 1:1 摩尔比独立产生，效率优于 IRES，但会引入少数氨基酸残留。

四、稳定过表达细胞系构建全流程（以小鼠 ES 细胞为例）

下面以小鼠胚胎干细胞中过表达转录因子 Pax6 为例，逐步利用说明PiggyBac 转座子系统构建稳定过表达细胞系的全流程。

1. 载体构建

（1）获取目的基因CDS：
从NCBI官网获取目的基因Pax6的CDS信息 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/18508，在mRNA and Protein(s)信息选项下，选择需要敲除的转录本进入，一般为最长最经典的那个isoform1，具体需要根据自己目的选择，这里选择了[NM_001244198.2]isoform1转录本。

进入页面后可以发现详细注释了基因的CDS区（蛋白编码区）和exon区（外显子区）等信息，我们需要将mRNA序列信息复制到snapgene或者word之类的软件上，标注好CDS区的注释信息。

根据序列信息，我们可以选择设计引物从 cDNA 文库扩增 Pax6 全长 CDS或直接合成基因获得 Pax6 全长 CDS。

如果是只能利用引物扩增，我们一般通过以下三个步骤获取：

• 首先第一步，我们需要一个富含Pax6 mRNA的 cDNA 文库，一般从高表达该基因的样品中收取RNA，反转录为cDNA文库。例如诱导多能干细胞分化为神经后收样，或者直接从小鼠神经组织中收样获取富含Pax6 mRNA的 cDNA 文库。
• 第二步设计引物扩增CDS片段，一般先在CDS外侧设计引物，利用高保真酶扩增包含了完整CDS的mRNA片段。
• 第三步，在成功扩增了包含CDS的mRNA片段的基础上，进一步设计引物扩增CDS目的片段，并在引物5’段带上酶切位点或者同源重组片段，便于后续连接进转座子质粒。

（2） 转座子供体质粒构建：
以最常见的piggybac dual promotor 质粒为例，该质粒设计的目的基因由CMV启动子驱动，如果是在干细胞中过表达其效率会极大降低，因此我们需要更换启动子，我们在这里可以更换为PX459基因敲除质粒中用到的CBh或EF1A等启动子。

首先我们利用CMVpromotor两侧的单一酶切位点，如SpeI和XbaI将原质粒的CMVpromotor切下来，得到缺失CMV启动子的线性化的转座子质粒。之后扩增PX459中的CBh启动子（包含CMV enhancer、chicken β-actin promoter、hybrid intron）并连接到该载体中替换CMVpromotor，测序验证得到质粒PB-CBh-MCS-EF1A-PuroR-GFP：

• 得到PB-CBh-MCS-EF1A-PuroR-GFP质粒后，在MSC位点选择合适的位点进行单酶切或者双酶切，回收质粒DNA得到线性化载体。

• 随后，我们将之前得到的Pax6 CDS通过酶切连接或者同源重组法插入MCS位点，并测序验证。注意，此时可以通过酶切连接法或同源重组法在ATG前引入Kozak序列GCCACC以提高表达量。构建成功后全质粒图谱如下：

  
  

（3）转座酶质粒：使用Super PiggyBac Transposase、 CAG-PBase 或同类质粒，需要确认 PBase 编码区正确。

（4）去内毒素质粒提取：两种质粒浓度不低于 500 ng/μL，A260/A280 在 1.8–2.0。

2. 细胞转染（电转为例）

• 细胞状态：对数生长期的 mESCs，电转前半天换新鲜培养基。
• 质粒用量：10 万细胞体系（10 μL 电转 tip）中，供体质粒与转座酶质粒总用量约 1 μg，常用比例 供体:转座酶 = 3:1 至 5:1（如 0.8 μg + 0.2 μg）。
• 电转操作：按小鼠 ES 细胞预设程序电击，移入明胶包被的培养皿，含 LIF 和 PD 的 ES 培养基，37°C 培养。

3. 药物筛选

• 转染后 24 h，换含PURO嘌呤霉素的 2i/LIF 培养基（浓度根据致死曲线确定，通常 0.5–1.0 μg/mL）。
• 每日换液，连续筛选 5–7 天，待抗性克隆生长。

4. 单克隆挑取与扩增

• 体视镜下挑取多个单克隆，胰酶或 TrypLE 消化后分散为单细胞，铺入 96 孔板或 24 孔板。
• 长满后每克隆传代两份：一份用于鉴定，一份低密度保种。

5. 表达鉴定

• qPCR 与 Western blot：检测目的蛋白 mRNA 和蛋白表达水平，与野生型及空载体对照比较。
• 长期稳定性评估：阳性克隆在无药条件下连续传代 10 代以上，每隔数代取样检测，确保表达量保持稳定。
• 流式分析（如含荧光标记）：直接检测荧光阳性率与强度。

6. 冻存保种

选择表达稳定无异常的 2–3 个克隆及时冻存于液氮中。

五、关键实验要点与常见问题

1. 启动子选错
在干细胞中使用 CMV 启动子是稳定过表达实验中最常见的失误。应优先选择 CAG、CBh 或 EF1α。如果载体容量充足，可以用 CAG 或EF1α；空间紧张则换用 CBh。

2. 供体质粒与转座酶质粒比例不当
转座酶不足则整合效率低，过量则增加细胞毒性和再转座风险。首次实验建议设置不同比例优化。

3. 转座子总长过大
全长超过 8–10 kb 时转座效率明显下降。优先使用 CBh 代替 CAG（节省约 1 kb）、PGK 驱动筛选标记、省略绝缘子（如对位置效应不敏感），几种策略组合可有效控制载体大小。

4. 筛选后不做单克隆比较
嘌呤霉素筛选后存活的细胞整合位置和拷贝数各异，表达水平可相差数十倍。挑取多个单克隆进行横向比较，才能筛选到表达水平适中且均一的理想克隆。

5. 基因沉默与位置效应
即使使用抗沉默启动子，整合到异染色质区域仍可能导致表达逐渐衰减。引入绝缘子可主动降低此风险。培养过程中即使加药维持，也需定期验证目的基因表达。

6. 二次转座的风险
已整合的转座子在再次引入 PBase 时可能被重新切出。如需对同一细胞进行二次基因操作，建议使用 Sleeping Beauty 等不同转座子系统交替进行。

六、与病毒载体、随机整合方法的简要比较

比较来看，PiggyBac 在构建稳定过表达细胞系时兼顾了高效整合、可控切除和操作简便的优势，特别适用于干细胞体系以及需要先整合后切除的实验设计。

结语

稳定过表达实验，不管是验证基因功能的回补实验，还是通过强制表达驱动细胞命运转变，最终都依赖于一个可靠且稳定的外源基因递送系统。

PiggyBac 系统以其独特的“剪切-粘贴”机制，在病毒载体和传统质粒转染之间走出了一条独特的路线：不需病毒包装即可高效整合，整合后保持稳定却又保留了可被切除的可能性。

启动子的选择和调控元件的配置在此过程中同等关键：CAG/CBh 保障了干细胞中的长期高表达，kozak序列是高效起始翻译的关键，绝缘子则主动防御位置效应带来的沉默风险。

从基因敲除到荧光敲入，再到转座子介导的稳定过表达，三种策略的侧重点各有不同。理解每套系统背后的设计逻辑，才能在实验开始之前就选对最适合自己研究目标的方案。

后续我们将继续推出基因诱导性表达系统（Dox-Teton、Sheild1-DD）专题，解析如何调控基因进行诱导性表达或者敲降，欢迎持续关注。