实验流程:
01蛋白提取
➊ 细胞样品在提取前需要使用PBS清洗两遍，以减少培养基对样品的干扰，悬浮细胞可500Xg低速离心后收集进行蛋白提取。贴壁细胞可在培养器皿中直接进行蛋白提取。蛋白提取前建议进行细胞计数，以确定提取中添加裂解液的比例，得到最佳提取效率。
❷ 组织样品在提取前也需要用PBS清洗，一些含血量丰富的组织，建议使用红细胞破裂液去除红细胞，以避免血液中IgG对后续实验的影响。
❸ 为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。
❹ 在提取蛋白的时候仅仅靠裂解液有时候也不能达到完全抽提的效果，有条件的话，可以对抽提悬液进行超声破碎处理；超声的时候，因为超声发热损伤蛋白，需要把要超声的样本放到冰水混合物里。
❺ 此外如果没有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替来抽提蛋白，其效果类似于SDS裂解液，不过抽提后的样本不能进行浓度测定。
❻ 蛋白煮沸变性一般是95-100°C，5-10min，水浴锅煮沸时，可用带夹EP管防止EP管盖弹开，使水浴锅内的水进入而使样品废掉。
02蛋白电泳
正确选择凝胶浓度与电泳条件能够让目的蛋白区域最大限度的分离开，从而使条带的位置，杂带位置等一些因素的影响降到最低；目的蛋白分子量与胶浓度的选择见下表：
蛋白质分子量范围(KD) 凝胶浓度(%)
<10 15
10-30 12
30-100 10
100-500 8
>500 6
采用SDS-PAGE电泳，每孔上样等体积总蛋白，上样时，先加marker，如有空置的加样孔，须加等体积的1×loading buffer，以防相邻泳道样品的扩散。开始电压为80V，使样品跑得慢一些，充分浓缩，到达分离胶后调为120V，电泳至溴酚蓝要跑出即可终止电泳。关于电泳液，建议新鲜配制，也可先配10x的，然后现用现稀释。
Tips：蛋白电泳
1、玻璃板清洗后，为了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置几分钟，拿出来的时候后需平衡至室温再灌胶，不然很容易产生气泡；
2、配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存，当我们按比例配好混合液的时候，要等混合液恢复室温时，再灌胶，不然也很容易产生气泡；
3、 玻加水液封时，速度要慢，可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动，不然很容易将分离胶冲变形；
4、梳子注意和玻璃板匹配，1.5mm的梳子很难插进1mm的玻璃板中，暴力插入会破坏胶板；如果1mm的梳子插到了1.5mm的玻璃板中，由于中间有空隙，就会有胶凝固在里面；
5、浓缩胶凝好可以泡到电泳缓冲液里，比较容易拔出。
03蛋白转膜 膜的选择
1、现在用的最多的是PVDF膜，用之前需注意：
1）先在纯甲醇中浸湿膜15s，保证PVDF膜充分活化；
2）将膜放入转膜缓冲液中平衡至少5min；
2、NC膜不需要甲醇活化。
膜的孔径
1、根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的印迹膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固；
2、通常用0.45μm和0.2μm两种规格的印迹膜。大于20KD的蛋白可用0.45μm 的膜，小于20KD的蛋白就要用0.2μm的膜。
小分子蛋白
1、小分子蛋白很容易转过，所以摸索适合自己蛋白的转膜条件很重要，这一步很难说一次就成功，所以刚开始的时候可以在接触胶面的PVDF膜上再放一张PVDF膜，转膜结束后，立春红染色，观察使用的条件是否会转过头；
2、 小分子蛋白转膜液中一定不要加SDS，因为SDS会影响转膜效果；
3、小分子蛋白湿转参考100V恒压，或者150-200恒流，40-60min，都可以跑出来结果，同时也可以保证内参的效果很好；
4、小分子蛋白转膜液甲醇浓度为20%；
5、分子量小于10 kDa的多肽或蛋白，建议使用Tricine-SDS-PAGE电泳和转膜系统。
大分子蛋白
1、转膜时间要适当延长，220V，300mA，湿转，建议时间在2h30min-3h，因为转膜时间很长，可以预冷转膜缓冲液，同时提前准备好足够的冰袋降温；
2、转膜液中可以加入适量SDS（浓度0.1%），对于大分子量蛋白加入SDS是为了增加了蛋白表面电荷，从而增加转膜效率；
3、大分子蛋白转膜液甲醇浓度为5%。
04印迹膜封闭
1、脱脂奶是最常用的经济配方。
2、脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素；建议使用BSA。
3、分析磷酸化蛋白须用BSA。脱脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化;也不适用于碱性磷酸酶(AP)检测系统。
4、如果用辣根过氧化物酶(HRP)检测系统，封闭液不应加叠氮钠(NaN3)，因为叠氮钠对辣根过氧化物酶（HRP）有灭活作用。
5、如果用二抗抗体是碱性磷酸酶(AP)标记的检测系统，可使用酪蛋白封闭，同时须选择TBS缓冲溶液，不可使用PBS缓冲溶液，因为PBS缓冲溶液干扰碱性磷酸酶。
05一抗二抗孵育
1、建议孵育抗体之前一定要仔细看抗体说明书，了解抗体的种属来源和抗体的建议稀释比例。
2、选择二抗抗体取决于一抗抗体的动物来源。例如,如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体,二抗抗体必须是抗小鼠的抗体；如果一抗抗体是兔来源多克隆抗体、二抗抗体必须是抗兔的抗体。
3、建议使用商品化的抗体稀释液稀释一抗二抗，不仅能有效减少一抗或二抗的非特异性结合，并有效提升稀释后抗体的稳定保存时间，可重复利用。
06显影成像
1、建议使用高信号强度、高灵敏度、高稳定性的ECL化学发光试剂。
2、显影液务必覆盖整个印迹膜。
3、显影液A液和B液吸取过程中必须更换移液器枪头，避免相互污染失效。
4、ECL工作液需避免强氧化剂如次氯酸钠等对工作液的影响。
5、须确保试剂瓶干净，无微生物或其它试剂污染。为了小伙伴们的安全，请穿实验服并佩戴一次性手套。
WB常见问题
01高背景
原因：
①抗体浓度太高
解决办法：优化/降低一抗和二抗的浓度
②抗体孵育温度过高
解决办法：4℃孵育
③二抗翡特异性结合或与封闭剂交叉反应
解决办法：设置二抗对照（不加一抗），降低二抗浓度
④一抗或二抗与封闭剂有交叉反应
解决办法：在孵育和洗涤液中加Tween-20减少交叉反应
⑤封闭不充分
解决办法：延长封闭时间，更换适合的封闭剂（脱脂奶粉、BSA、酪蛋白）
⑥抗体与其它蛋白质交叉反应
解决办法：更换不同的封闭液；勿在含生物素体系中使用脱脂奶粉封闭；降低二抗浓度；检测二抗与膜的交叉反应性。
⑦洗膜不充分
解决办法：增加洗涤次数
⑧膜干燥
解决办法：保证充分的反应液，避免出现干膜现象。
02 信号弱或无信号
原因：
①抗体
解决办法：增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体是丧失活性
②抗原不足
解决办法：增加上样品
③抗原被封闭液遮蔽
解决办法：试用不同的封闭液；优化封闭液中蛋白质浓度；缩短封闭时间
④蛋白质样品在储存过程中降解
解决办法：重新制备样品
⑤转膜不充分，或洗膜过度
解决办法:使用丽春红检测转膜效果，PVDF膜需浸透，需正确的转膜操作，勿过度洗膜
⑥过度封闭
解决办法：勿过度洗膜
⑦；过度封闭
解决办法：使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少封闭时间
⑧一抗失效
解决办法：使用有效期内的抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作液现配现用
⑨酶和底物失效
解决办法：直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物，使用新鲜的底物
03 非特异性带条
原因：
①一抗浓度过高
解决办法：在满足一定的敏感性的情况下，降低一抗浓度
②二抗引起的非特异条带
解决办法：免疫球蛋白是一个超家族，而标本中含有大量的类似球蛋白的抗体，容易和二抗引起反应，尤其是砸变性的情况下，在满足敏感性要求的前提下，荧光标记一抗，酶标兔抗荧光就可以解决这个问题
③蛋白的降解
解决办法：同上【2—（4）】
④上样量过高
解决办法：适当减少上样量
⑤洗涤不完全
解决办法：可适当延长洗涤时间
⑥封闭不好
解决办法：延长封闭的时间；选择更适合的封闭液
04 弥散型条带
原因：
①抗体浓度太高
解决办法：降低抗体浓度
②蛋白质上样量太多
解决办法:降低蛋白质上样量
③迁移过快、电泳温度过高
解决办法：降低电泳速度，低温电泳（冷室）
