本文选自cell proliferation DOI: 10.1111/cpr.12816，喜欢的朋友可以自行下载
啥也不说，上图。
本文所选择Pin1是基于作者先前的实验基础，Pin1通过c-Myc/NRF2轴维持氧化还原平衡，在支持胰腺癌生长中发挥致癌作用，并强调它是PDAC的一个独立的预后标志物,应用RNA测序技术检测野生型(WT)细胞、空载体(EV)转染细胞和Pin1过表达的MIAPaca-2细胞的基因表达谱，以探索潜在的靶点。然后，根据GSEA中的数据集分析不同的组。在所有特征中，“TNFA_Signal_Via_NFKB”和“IL6_JAK_STAT3_SIGALING”在Pin1过表达组和EV/WT组之间显示出最高的归一化富集评分,此外，高表达的基因显然与改变的信号通路有明确的联系.
作者进一步将两组间比较的重点聚集在NF-RB通路上，对比了两个比较足组之间的在NF-RB通路上差异表达的基因。观察到两个热图中的几个相互作用的基因，包括IL-18、TNF、TNFAIP3等，表明它们可能强烈参与PIN1高表达相关的NF-κB信号转导。（也就是两者取了个交集）
为了验证发现，根据之前关于Pin1在PDAC中的作用的研究，另外稳定地将Pin1特异性shRNA转染Capan-1和SW1990细胞。qPCR结果显示，在Pin1过表达的MIAPaca-2细胞中IL-18的mRNA水平升高，而在Pin1基因敲除的Capan-1和SW1990细胞中IL-18mRNA的表达水平降低。此外，Pin1过表达的MIACapa-2细胞株IL-18蛋白表达上调，而Pin1基因敲除的Capan-1和SW1990细胞IL-18表达显著降低，细胞培养上清液中IL-18的分泌水平也显著降低。因此，PIN1在胰腺癌细胞中可能激活NF-κB信号，并与IL-18的表达相关。
然后，作者又进一步在组织水平验证了Pin1与IL18的表达以及预后的关系，确定了其临床意义。
然后作者又作了一波Pin1和IL18的功能学实验。也可能作者以前实验做过Pin的功能学实验，所以这里他做的是Pin1和IL18的分组较少。中心思想就是Pin1调控了IL18，显示出在侵袭、增殖方面的功能。文中rescue实验用了重组人白细胞介素18rhIL18.
既然验证了表型，那么Pin1是否通过NF-rB通路调控了IL18的表达呢，作者进一步验证了Pin1在调控NF-RB中的作用，PIN1在一些癌细胞中被鉴定为P65的正调控因子。为了确定PIN1-P65在胰腺癌细胞中是否发生相互作用，进行了内源性CoIP。结果表明，在CAPAN-1和SW1990细胞中，内源性Pin1与p65相互作用。P65的磷酸化也因Pin1的差异表达而改变。p65和p-p65的核表达也被Pin1的表达显著改变，而p65的总体细胞表达没有变化，这表明Pin1在p65易位和磷酸化后的转录活性中发挥了作用，免疫荧光分析也证实了Pin1的过表达促进了细胞质p65的移位到MIA Paca-2细胞的细胞核中，接下来，我们评估了PIN1对NF-κB转录活性的影响，这是通过NF-κB-荧光素酶实验证明的。双荧光素酶分析显示，在CAPAN-1和SW1990细胞中，PIN1的表达以剂量依赖的方式增加了NF-κB的活性。
小朋友，是不是有很多问号，别急，我来解决你的疑惑，上梁子。这个NF-RB有可能就是破解炎癌转换过程的枢纽（我就把这1个亿的项目撂这了，拿不拿你自己看着办吧），小伙伴们，有相关领域的赶紧操练起来啊。NF-kB家族有5个成员，包括NF-kB1（p50）、NF-kB2（p52）、RelA（p65）、RelB和c-Rel，通常所说的NF-kB蛋白，是指p65/p50亚单位形成的NF-KB1二聚体蛋白；RelB/p52亚单位形成NF-kB2二聚体蛋白，研究发现，激活NF-kB的信号转导通路主要有以下三种:经典通路、旁路通路和非典型通路。NF-kB1，RelA，c-Rel，均由经典通路激活，而NF-kB2，RelB，由旁路通路激活，此外还有DNA氧化损伤等诱导的非典型通路；p65的翻译后修饰，也调节NF-kB通路活性（这么看来作者的研究基本都是基于已知结果的研究）关于这个通路，喜欢的可以自己阅读以下https://baike.baidu.com/item/NF-kB%E4%BF%A1%E5%8F%B7%E9%80%9A%E8%B7%AF/7060376?fr=aladdin
但是这个P65和IL18有什么关系呢，再者说IL18怎么又构成了loop了呢？且听作者缓缓道来。为了了解p65在IL-18表达中的作用，建立了稳定的p65基因敲除的CAPAN-1和SW1990细胞系。稳定的p65基因敲除导致IL-18蛋白表达降低。经肿瘤坏死因子α处理4h后，p65诱导的IL-18mRNA水平升高，但p65基因敲除细胞系的这种影响明显减轻，TCGA-PAAD队列的数据验证了p65和IL-18之间的相关性。
此外，GSEA分析发现，高IL-18表达相关信号“TNFA_Signal_Via_NFKB”表现出最高的NES，P<0.001(图5e)，这表明高IL-18与NF-κB途径的升高密切相关。随后的Westernblot分析表明，rhIL-18刺激CAPAN-1和SW1990细胞增加了细胞核p65的表达，双荧光素酶分析表明，在CAPAN-1和SW1990细胞中，IL-18的表达以剂量依赖的方式增加了NF-κB的活性，在IL-18启动子中，存在一个保守的p65结合元件，该元件与一个相对不保守的元件相邻。因此，我们设计了覆盖这两个结合位点的引物，并进行了CHIP，以探索P65是否可以占据其中一个结合位点。芯片结果显示P65可以与该区域相互作用，进一步的芯片分析表明P65可以占据两个结合元件中的任何一个。
这里作者的反馈环路就构建完成了，但是如何证明Pin1是通过NF-RB途径调节IL18的呢？作者用TNF-a诱导IL18表达，然后在敲减了Pin1的细胞中用TNF-a不能诱导IL18表达，在蛋白质和RNA水平双重验证。这里他们用的是上清中的IL18,因为IL18是分泌蛋白，所以细胞中的水平不一定会高，如果做分泌蛋白的同学，一定要注意了，要不然可能跑不出想要结果。
将IL-18启动子区克隆到荧光素酶载体上，然后与Pin1表达载体和/或p65表达载体共转染。双荧光素酶分析显示Pin1以剂量依赖方式增强IL-18启动子活性。当转染Pin1和P65比只转染Pin1时IL18启动子活性更高，结果提示Pin 1可能激活p65在IL-18启动子上的转录活性，为了发现Pin1和p65与IL-18启动子区染色质的相互作用，我们发现Pin1基因敲除组IL-18启动子上p65的占有率降低，提示Pin1通过p65活性影响IL-18转录，Pin1和P65在CAPAN-1和SW1990细胞系中主要共定位，因此，我们推测Pin1和P65可能与IL-18启动子相互作用。CHIP结果显示，Pin1也可以占据p65能够结合的两个结合元件中的任何一个。重新CHIP显示Pin1和p65占据了IL-18启动子的相同区域。随后的荧光素酶检测表明，当两个结合侧的任何一个序列发生突变时，Pin1和p65对突变的荧光素酶报告基因的积极影响降低。当两个序列都发生突变时，正效应完全丧失。
至此，本文结束，挺好的一篇文章，虽然发的是5分的杂志，主要还是创新性不足，但是我觉得再动物上在捯饬捯饬肯定可以发个更高的点数，这篇文章结构紧凑，逻辑严谨，适合学习，文章还提到另外一个通路，还没有头绪的同学可以试试。欢迎批评、指正。
