系列笔记基于达澈生物讲座视频，从中初步学习了解生信分析中常遇到的组学分析技术。
ChIP-seq和 CUT&Tag、CUT&RUN讲座视频笔记 - 简书
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0、总纲
- ChIP-seq是探究有特定蛋白结合的DNA片段，即蛋白与DNA特定区域的互作关系；
-
CUT&RUN、CUT&TAG是近些年提出的两个更高效的实验设计。
image from ENCODE
1、ChIP-seq（Chromatin Immuno-Precipitation）
染色体免疫共沉淀反应
1.1 上游实验原理
A 实验步骤
参考下图，主要分为5步
（1）甲醛交联
- 将目标蛋白（根据实验目的而定）紧密绑定到其可以与DNA连接的位置上；
- 目标蛋白是我们感兴趣的蛋白，例如有特定修饰的组蛋白；
- 我想就是为避免下一步超声时脱离；
（2）超声打断
- 将所有DNA打断成一定长度的小片段；
-
所有片段可分为两大类：有特定蛋白结合的，无特定蛋白结合的
5 steps of ChIP-seq
（3）片段富集
- 根据目标蛋白，添加特异抗体，形成抗体与目标蛋白免疫沉淀复合物；
- 然后用磁珠分离富集
（4）文库构建
- 去交联，纯化DNA；
- 加接头，扩增
（5）测序
- illumina二代测序
B 技术难点
（1）实验步骤较多，参数设置优化
- 例如交联、超声等参数设置需要实验摸索；
- 整个实验周期大概三天左右。
（2）抗体选择
- 对于任何一种特定的靶抗原，都有不止一种有效抗体；
-
如何筛选高质量的抗体是很重要的（因为不做实验，就不细述了）
磁珠对蛋白免疫沉淀复合物的富集.png
（3）结果解读
chip-seq的结果有时存在背景高、非特异性的peak的缺点；即目标DNA片段分布不是很集中。原因可能如下
- 甲醛过度交联导致蛋白与非目标DNA位置结合；
- 非特异性DNA与Bead直接结合（solution：可用Salmon Sperm DNA封闭）；
- 抗体特异性不强；
- ........
C 对照设计
（1）input对照（必做）
即相同实验条件下，进行到第二步超声打断的结果。目的主要是
-
可以验证DNA断裂的效果（片段长度分布）
sonication超声 - 可根据input中靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列含量，按照取样比例换算出CHIP的效率；
（2）阳性对照（选做）
主要目的是验证chip-seq实验理论上有目标蛋白结合就会出现peak的
- 一般使用anti-RNA PolymeraseⅡ抗体；
- 因为该抗体是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区。因此理论上chip后都会有条带。
（3）阴性对照（选做）
主要目的是验证chip-seq实验理论上没有目标蛋白结合就会不出现peak的
- 一般用普通的IgG抗体
阳性、阴性对照的例图可见笔记最后
1.2 下游数据分析
参考下图，chip-seq的数据分析常规流程如下
（1）RAW data→Clean data
- 质控（QC）；
- 去接头(cutadapt)
（2）Alignment
- bwa、bowties等biosoft，重点关注mapping rate
- visualization(deepTools/IGV)
（3）Peakcalling
- ChIP-seq的必做步骤，研究蛋白bindinng的DNA片段相对集中区域
- MACS2软件，之前的关于MACS笔记见链接
-
根据peak分布结果可进一步尝试motif analysis(Homer)，gene annotation(Homer)→GO/KEGG(R)，并且联和RNA-seq DEG、ATAC-seq等
image from 达澈生物
2、CUT&RUN、CUT&TAG
- ChIP-seq主要用超声打断的方式切割DNA片段，
- 近些年出现的CUT&RUN、CUT&TAG则主要利用酶切的方式
2.1 cut&run
cleavage under targets and release using nuclease
大致步骤如下
- （1）抗体结合绑在DNA上的靶向蛋白；
- （2）Protein A-MNase酶复合物与抗体交联；
MNase酶为DNA内切酶，可切断所识别到的DNA片段
- （3）钙离子激活MNase酶，剪下目标蛋白所连的目标DNA片段；
- （4）蛋白复合物富集
2.2 cut&tag
cleavage under targets and tagmentation
大致步骤如下
- (1) 一抗结合目标蛋白，二抗结合一抗(信号放大)；
- (2) 加入protein A-Tn5酶复合物
Tn5酶是转座酶，ATAC实验常用，完成剪切、粘贴的作用；
- 剪下目标蛋白所连接的目标DNA片段，并在两边加上接头（建库更方便）
2.3 相比于ChIP-seq的优势
- 实验材料(细胞)使用量少，适合珍贵样品；
- 不需要超声打断，因此也可不做甲醛固定（前提是新鲜细胞）；
- 实验周期短，两天左右；
- 数据背景信号非常低！可参考一篇paper的比较
